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Philipp Gebhardt

• Many metabolic pathways of eukaryotes are carried out in form of interconnected pathways, which take place in organelles. The organelle membrane separates the reaction compartments from each other, making it a key feature of organelle existence in the cell. To maintain cellular homeostasis, organelle positioning in and transport through the cell as well as organelle interaction are important for the organisms. In plants, organellar movement of peroxisomes, Golgi stacks and mitochondria was shown to be mediated by the actin-myosin machinery. The molecular mechanisms are not elucidated, but working models comprise classical movement mechanisms of motor proteins pulling their cargo on cytoskeletal filaments. In contrast, many mechanisms of chloroplasts movement, which are regulated by blue and red light, are deciphered but follow a different molecular mechanism. Plastidal relatives of the chloroplast have long been disregarded by scientific research but carry out important metabolic reactions to maintain cellular homeostasis. The cellular transport and movement mechanisms of root plastids have not been described in detail until now. Additionally, all plastid subspecies can form tubular structures, called stromules. Those are thought to be involved in the organelle communication and metabolite exchange. Since they are very mobile structures, they influence the organellar dynamic of plastids. This work aimed for an in-detail description of the cellular movements of root plastids in the plant Arabidopsis thaliana to elucidate underlying mechanisms of their movement. Additionally, the dynamics of root plastid stromules were investigated, led by the questions, if and how stromules are involved in the mediation of plastidal movement and their overall dynamics. Plastidal movement in Arabidopsis thaliana was captured using light sheet-based fluorescence microscopy. 4D image data was automatically analyzed using the program Arivis Vision 4D with subsequent manual correction. Additionally to the 4D approach, a manual 3D analysis of plastid and stromule dynamics was performed. The results of the semiautomated analysis displayed heterologous distribution of the plastidal movement. Using a combination of the vector length of each motion event and the angle in relation to previous motion vectors, the proportions of different movement patterns were determined. Main fractions of the data showed undirected motion of plastids, whereas small proportions displayed directed movement with speed up to 8.5 µm/sec. Directed motion was shown to be carried out on defined routes in the cell. Salt stress did not affect plastidal motion, whereas drought stress lead to its reduction. Sucrose depletion led to a drastic decrease of plastidal movement. Additionally, stromule dynamics were investigated using the acquired image data. Stromules were observed in high frequency mainly at stationary plastids giving them the opportunity of dynamic interaction in their cellular surrounding. Stromules reached lengths of up to 60 µm. Additionally, they displayed a variety of movement patterns that contributed greatly to the overall plastid dynamics. Stromule related motion events were captured reaching up to 3.2 µm/sec. Similar to determined plastid dynamics, stromule motions were reduced during drought stress and sucrose depletion, but also were negatively influenced by salt stress. Those results strongly favor an actin-myosin mediated movement machinery mediating the plastidal and stromule movement. This stands in contrast to previous results describing the movement mechanisms of light induced chloroplast movement. In an additional approach, the molecular mechanisms underlying stromule formation were analyzed. Previous results describe that stromule formation can be induced at isolated chloroplasts of the plant Nicotiana benthamiana by mixing it with concentrated cell extract. During this work, a variation of the described assay was established using the plant Pisum sativum. It was shown that an unknown protein factor presumably undergoing protein-lipid interaction is responsible for in vitro stromule formation. Using a combination of sucrose gradient centrifugation and anion exchange chromatography, the desired factor could be enriched, while the majority of unwanted proteins could be reduced drastically. A following LC-MS analysis revealed a selection of proteins with membrane interaction- and unknown functions that might be involved in in vitro stromule formation.
• Die Funktion einer Zelle ist abhängig von der Zellform. Im Zuge der Evolution haben sich unterschiedliche Zellformen herausgebildet, die in der Regel eine Maximalgröße von 100 μm im Durchmesser nicht überschreiten. Die Größe einer Zelle ist maßgeblich von intrazellulären Transportprozessen abhängig, die unter anderem die sogenannte zytoplasmische Strömung antreiben. Dieses Phänomen ist für eine Vielzahl von Zellen bekannt und wurde sehr genau bei Grünalgen der Familie Characeae untersucht, da die zytoplasmische Strömung in dieser Familie sehr ausgeprägt ist. Die zytoplasmische Strömung ist eine prominente Eigenschaft von Pflanzenzellen und ihre Ausprägung und Form ist abhängig von der Pflanzen- und Zellart. Lange Zeit wurde geglaubt, dass neben Nährstoffen auch Zellorganellen passiv im zytoplasmischen Strom treiben. Jedoch wurden des Öfteren Organellen beobachtet, die sich entgegen des zytoplasmischen Stroms bewegten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass erst durch den aktiven Transport von Organellen die intrazelluläre Zytoplasmaströmung erzeugt wird. Diese Beobachtungen ließen darauf schließen, dass die Positionierung der Organellen in der Zelle sehr definiert ist und einer gewissen Funktion unterliegt. Da im Zuge der Evolution durch Zellorganellen spezielle Reaktionsräume in der Zelle abgegrenzt worden sind, wurde die Grundlage für eine komplexe miteinander verflochtene Zellstruktur geschaffen. Verschiedene metabolische Prozesse finden in separaten Reaktionsräumen statt, die durch Membranen voneinander abgegrenzt sind. Die exakte Funktion der verflochtenen metabolischen Prozesse ist wichtig für den Erhalt der zellulären Homöostase. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, dass Organellen für eine einwandfreie Funktion der Zelle Stoffaustausch miteinander betreiben und miteinander kommunizieren müssen. Organelläre Interaktion wurde oft und bei verschiedenen Organellen beschrieben. Für eine optimale Interaktion zwischen den Organellen ist eine variable, aber gezielte Positionierung der Organellen in der Zelle von Nöten. Dies impliziert die Notwendigkeit des gerichteten Transports von Organellen. Gerichteter intrazellulärer Transport wird in der Regel mit Hilfe des Zytoskeletts und Motorproteinen betrieben, die entlang des Zytoskeletts Zellbestandteile durch die Zelle transportieren. In pflanzlichen Zellen findet der meiste aktive intrazelluläre Transport mit Hilfe von Aktin Filamenten und den sich darauf bewegenden Myosin Motorproteinen statt, die Bewegungsgeschwindigkeiten von bis zu 7 μm/sec in der Pflanze Arabidopsis thaliana erreichen können. Mikrotubuli und die Motorproteine, die sich auf ihnen bewegen, sogenannte Kinesine, spielen im intrazellulären Transport von Pflanzen eine untergeordnete Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass die Bewegung von Peroxisomen, Golgi Stapeln und Mitochondrien mit Hilfe des Aktin-Myosin Gespannes angetrieben wird. Jedoch konnte kein spezifisches Myosinprotein dem Transport einer Zellorganelle zugeordnet werden. Es konnte gezeigt werden, dass die vier am stärksten exprimierten Myosine in der Pflanze Arabidopsis thaliana redundante Funktionen in dem Transport der Zellorganellen haben und nur ein multipler Knockout der verschiedenen Gene konnte eine Verlangsamung des Organelltransportes herbeiführen. Obwohl mit den beschriebenen Experimenten eine Beteiligung der Aktin-Myosin Maschine am Transport der drei Organelltypen gezeigt wurde, sind die genauen molekularen Mechanismen, die dem Transport unterliegen bis jetzt nicht genau entschlüsselt. Daher gibt es verschiedene Modelle, mit denen die Organellbewegung beschrieben werden kann. Entweder wird die Organellbewegung durch eine direkte Interaktion von Motorproteinen mit dem Zytoskelett und der entsprechenden Organelle mediiert, durch eine indirekte Interaktion mit dem Motorprotein, indem Organellen miteinander Interagieren, aber nur eine der Organellen von Motorproteinen transportiert wird, oder durch einen Mixtur, in der Organellen aktiv durch die Zelle transportiert werden, dadurch die zytoplasmische Strömung initiieren mit deren Hilfe andere Organellen durch den Strom in der Zelle verteilt werden. Die Organellbewegung in der Pflanze wurde bisher meistens in grünem Gewebe untersucht. Dazu gehört auch die Bewegung von Chloroplasten, die sehr gut verstanden ist, jedoch einem anderen molekularen Mechanismus folgt, als die klassischen Arbeitsmodelle der Organellbewegung postulieren. Chloroplasten gehören zu der Organellfamilie der Plastiden, die neben den photosynthetischen Chloroplasten im grünen Pflanzengewebe auch diverse bisher meist wenig erforschte Verwandte beherbergt. Da die Bewegung von Chloroplasten durch Blau- und Rotlicht induziert wird, dieses jedoch in der Wurzel normalerweise nicht vorhanden ist, liegt die Vermutung nahe, dass Plastiden in der Wurzel, zumeist Leukoplasten, einen anderen Mechanismus besitzen, der ihre Bewegung antreibt.