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Jan Gerrit Löffler

• Experiments on Vibrational Energy Transfer (VET) in proteins contribute to our understanding of fundamental biological processes such as allostery, dissipation of excess energy, and possibly enzymatic catalysis. While these processes have been studied for a long time, many questions remain unanswered. The aim of this work was to expand the application of existing spectroscopic techniques to investigate VET, seeking tailored solutions for the diversity of proteins and amino acid environments. Additionally, new target proteins were to be established to broaden the spectrum of VET experiments towards the role of VET and low-frequency protein modes (LFMs). To test their suitability as VET sensors, the non-canonical amino acids (ncAAs) Azidoalanine (N3Ala), azido-L-Homoalanine (Aha), p-azido-Phenylalanine (N3Phe), p-cyano-Phenylalanine (CNPhe), and 4-cyano-Tryptophan (CNTrp) were coupled to the VET donor β-(1-azulenyl)-L-Alanine (AzAla) in dipeptides. Their spectral properties were compared using FTIR and VET spectra in H2O, dimethyl sulfoxide, and tetrahydrofuran. The solvent strongly influences the measured VET signals, which can be explained by the direct interaction of the solvent with the dipeptides. Additionally, the peak time within the subgroups of azide and nitrile sensors increased with the size of the side chain, indicating the dependence between peak time and the distance between VET donor and sensor. When incorporated into a protein, solvent interactions are less dominant. Therefore, Aha, N3Phe, and CNPhe were additionally incorporated at two different positions in the PDZ protein domain and investigated. Due to Fermi resonances, signals from azide sensors are challenging to predict, unlike those of the nitrile sensors. Overall, the experiments showed that nitrile groups can serve well as VET sensors, as their lower extinction coefficient is compensated for by a narrower bandwidth. This expands the number of potential target proteins, and sensor incorporation can be less disruptive at various protein locations. Since the VET donor AzAla can inject the energy of a photon into a protein as vibrational energy at a specific location, it can also be used for the targeted excitation of LFMs. If these modes are involved in an enzymatic reaction, a direct influence on activity is expected. This hypothesis has long existed but has not been definitively verified. Some studies have found evidence for the involvement of LFMs in formate dehydrogenase (FDH) catalysis. Therefore, FDH was chosen for the investigation of LFMs in enzymes. This specific system additionally allows the use of a natural VET sensor: it forms a stable complex with NAD+ and N3-, an excellent IR marker. Thus, it provided the opportunity to test low-molecular-weight non-covalent ligands as VET sensors. After ensuring sufficient AzAla supply through the internal establishment of an enzymatic synthesis, AzAla could be incorporated at various positions in FDH. Despite spectral overlap between free and bound N3-, the latter could be identified by its narrower FWHM. For some variants, no binding could be observed. Circular dichroism spectra showed that these variants structurally deviate slightly from other variants and the wild type (WT). VET could be observed over 22 Å from two regions of the protein to the N3- bound in the active center, at protein concentrations of below 2 mM. Unbound N3- did not generate signals, allowing it to be added in excess ensuring the saturation of the protein in VET experiments. The activity of FDH WT and four AzAla mutants was investigated under substrate saturation without and with AzAla excitation. In these experiments, a slight reduction in activity under illumination was observed, even for the WT, who is not expected to interact with the excitation light. So far, a difference in sample temperature cannot be excluded as the cause for this decline. The presented experiments with FDH illustrate the potential of low-molecular-weight ligands as VET sensors, with N3- being particularly attractive due to its simple structure (preventing Fermi resonances) and its high extinction coefficient. Its use can add many metalloproteins as potential targets for VET experiments and allows investigation without a VET sensor ncAA. Additionally, initial experiments were conducted to measure light-dependent FDH activity. By specifically exciting protein LFMs, this project could contribute in the future to answering longstanding questions about the extraordinary catalytic efficiency of enzymes.
• Experimente zu Schwingungsenergietransfer (VET) in Proteinen tragen zu unserem Verständnis grundlegender biologischer Prozesse wie Allosterie, Dissipation von Überschussenergie und möglicherweise enzymatischer Katalyse bei. All diese Prozesse werden schon seit langem untersucht, doch viele Fragen sind nach wie vor unbeantwortet. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Anwendungsbereiche der bestehenden spektroskopischen Technik zur Untersuchung von VET zu erweitern, um maßgeschneiderte Lösungen für die Vielfalt von Proteinen und Aminosäureumgebungen zu finden. Außerdem sollten neue Zielproteine etabliert werden, die das Spektrum der VET-Experimente in Richtung der Rolle von VET und niederfrequenter Proteinmoden (LFMs) erweitern. Um ihre Eignung als VET-Sensoren zu testen wurden die nicht-kanoninschen Aminosäuren (ncAAs) Azidoalanin (N3Ala), azido-L-Homoalanin (Aha), p-azido-Phenylalanin (N3Phe), p-cyano-Phenylalanin (CNPhe) und 4-cyano-Tryptophan (CNTrp) in Dipeptiden an den VET-Donor β-(1-azulenyl)-L-Alanin (AzAla) gekoppelt. Ihre spektralen Eigenschaften wurden anhand von FTIR- und VET-Spektren in H2O, Dimethylsulfoxid und Tetrahydrofuran verglichen. Das Lösungsmittel hat einen starken Einfluss auf die gemessenen VET-Signale. Dies kann durch die direkte Wechselwirkung des Lösungsmittels mit den Dipeptiden erklärt werden. Außerdem nahm die Peakzeit innerhalb der Untergruppen der Azid- bzw. Nitrilsensoren mit der Größe der Seitenkette zu. Dies zeigt die Abhängigkeit zwischen der Peakzeit und dem Abstand zwischen VET-Donor und Sensor. Beim Einsatz in einem Protein, sind die Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel weniger dominant. Daher wurden Aha, N3Phe und CNPhe zusätzlich an zwei verschiedenen Stellen in die PDZ-Proteindomäne eingebaut und untersucht. Aufgrund von Fermi-Resonanzen sind die Signale der Azidsensoren schwer vorhersehbar, dies ist bei den Nitrilsensoren nicht der Fall. Insgesamt zeigten die Experimente, dass Nitrilgruppen gut als VET-Sensoren dienen können, da ihr niedriger Extinktionskoeffizient durch eine schmalere Bandenbreite kompensiert wird. Dadurch erhöht sich die Zahl der potenziellen Zielproteine, und der Sensoreinbau kann an verschiedenen Stellen des Proteins weniger störend sein. Da der VET-Donor AzAla die Energie eines Photons als Schwingungsenergie ortsspezifisch in ein Protein einspeisen kann, kann er auch zur gezielten Anregung von LFMs verwendet werden. Wenn diese Moden an einer enzymatischen Reaktion beteiligt sind, wird ein direkter Einfluss auf die Aktivität erwartet. Diese Hypothese besteht bereits seit langem, konnte jedoch noch nicht endgültig verifiziert werden. Einige Studien haben Hinweise für die Beteiligung von LFMs an der Katalyse in Formiatdehydrogenase (FDH) gefunden. Daher wurde FDH für die Untersuchung von LFMs in Enzymen ausgewählt. Dieses spezifische System ermöglicht zusätzlich die Verwendung eines natürlichen VET-Sensors: es bildet einen stabilen Komplex mit NAD+ und N3-, einem hervorragenden IR-Marker. Es bot damit die Möglichkeit, niedermolekulare nicht-kovalente Liganden als VET-Sensoren zu testen. Nachdem die Versorgung mit ausreichend AzAla durch die interne Etablierung einer enzymatischen Synthese ermöglicht wurde, konnte AzAla an verschiedenen Positionen in FDH eingebaut werden. Trotz des spektralen Überlapps von freiem und gebundenem N3-, konnte letzteres durch seine schmalere FWHM identifiziert werden. Für einige Varianten konnte keine Bindung beobachtet werden. Durch Zirkulardichroismus-Spektren konnte gezeigt werden, dass diese Varianten strukturell leicht von den anderen Varianten und dem Wildtyp (WT) abweichen. VET konnte über 22 Å aus zwei Regionen des Proteins zu dem im aktiven Zentrum gebundenen N3- beobachtet werden. Frei vorliegendes N3 erzeugte keine Signale, sodass N3- in den VET-Experimenten im Überschuss vorliegen und die Sättigung des Proteins sichergestellt werden kann. Die Aktivität von FDH WT und vier AzAla-Mutanten wurde unter Substratsättigung ohne und mit Anregung von AzAla untersucht. In diesen Experimenten wurde eine leichte Verringerung der Aktivität unter Beleuchtung beobachtet. Bisher kann ein Unterschied der Probentemperatur als Grund für diesen Rückgang nicht ausgeschlossen werden. Die vorgestellten Experimente mit FDH verdeutlichen das Potenzial von niedermolekularen Liganden als VET-Sensoren, wobei N3- aufgrund seiner einfachen Struktur (die Fermi-Resonanzen verhindert) und seines hohen Extinktionskoeffizienten besonders attraktiv ist. Seine Nutzung kann viele Metalloproteine zu den potenziellen Zielen für VET-Experimente hinzufugen und ermöglicht eine Untersuchung ohne VET-Sensor ncAA. Darüber hinaus wurden erste Experimente zur Messung der beleuchtungsabhängigen FDH-Aktivität durchgeführt. Durch die spezifische Anregung von Protein-LFMs könnte dieses Projekt in Zukunft dazu beitragen, eine Antwort auf die seit langem bestehenden Fragen nach der außerordentlichen katalytischen Effizienz von Enzymen zu finden.