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Julia Rauheja Hadhoud

• Das Hepatoblastom ist ein embryonaler Lebertumor, dessen Zellen unterschiedliche unreife Stadien aufweisen. Aufgrund dieser Unreife ist die Identifizierung von Krebsstammzellen erschwert, die in diesem Tumor vermutet und für Rückfälle verantwortlich gemacht werden. In Vorarbeiten konnte eine Krebsstammzellpopulation mit der Kombination der hämatopoetischen Stammzellmarker CD90 und CD34 sowie dem „oval cell“ OV-6-Antikörper in den etablierten Hepatoblastomzelllinien HuH6 und HepG2 detektiert werden. Diese CD34+OV-6+CD90+ Zellen wiesen eine erhöhte Expression von Pluripotenzfaktoren auf und zeichneten sich durch ein erhöhtes Migrationsverhalten aus. In der hier vorgelegten Arbeit wurden zunächst Tumor-Sphäroid-Assays durchgeführt um diese Population als Krebsstammzellen zu bestätigen, da nur Krebsstammzellen unter den gegebenen Umständen wachsen können. Diese waren im Anschluss wieder in der Lage, in „normalem Medium“ zu differenzieren. Des Weiteren wurden die Zelllinien mit dem Standardtherapeutikum Cisplatin behandelt. Da Krebsstammzellen als chemoresistent gelten, konnte in der überlebenden Zellpopulation auch eine Anreicherung der CD34+OV-6+CD90+ Zellen beobachtet werden. Zusätzlich ließ sich eine weitere CD34+OV-6+CD90+ Population identifizieren, deren Expression aller drei Marker schwächer war und die bei steigenden Cisplatin-Konzentrationen den Großteil der CD34+OV-6+CD90+ Population ausmachte. Neben den erhöhten Transkriptmengen der Pluripotenzmarker Oct4 und Nanog zeichneten sich die CD34+OV-6+CD90+ Krebsstammzellen durch eine verstärkte Expression der aktivierungsinduzierten Zytidin-Desaminase AID aus. AID wirkt induzierend auf die Transkription beider Pluripotenzmarker. Daher könnte es auch bei Krebsstammzellen eine Rolle bei der Induktion von Pluripotenz und bei ihrer langfristigen Erhaltung spielen. Dies unterstützend legten die verminderten Transkriptmengen der Pluripotenzgene nach einem AID siRNA Knock-Down eine Abhängigkeit des Stammzellcharakters von diesem Faktor nahe. Um einen Effekt von Therapeutika, die inhibitorisch auf AID wirken, auf Krebsstammzellen zu untersuchen, wurden die Zellen mit den DNMT-Inhibitoren Decitabine und Zebularine sowie dem HSP90-Inhibitor Tanespimycin behandelt. Tatsächlich konnte vor allem in den HuH6-Zellen ein verminderter Anteil der Krebsstammzellpopulation durch die drei Substanzen beobachtet werden. Wurden die Zellen im Anschluss mit dem Standardzytostatikum Cisplatin behandelt, führte allerdings eine Vorbehandlung mit Zebularine oder Decitabine zu einer starken Anreicherung von Krebsstammzellen. Dies war vor allem auf Zellen mit dem schwach positiven CD34+OV-6+CD90+ Expressionsprofil zurückzuführen, die chemo-induziert zu sein scheinen. Zwar erscheint die Mehrheit der Tumorzellen eliminiert zu werden, jedoch lassen diese Ergebnisse die Entstehung von chemo-induzierten Krebsstammzellen vermuten, die langfristig für einen Rückfall verantwortlich sein könnten. Daher ist von einer Ergänzung der Therapie mit diesen Substanzen abzusehen. Eine Vorbehandlung mit Tanespimycin hingegen konnte im Vergleich zur alleinigen Cisplatin-Behandlung wirksam den Anteil der Krebsstammzellen reduzieren. Interessanterweise war dies nicht auf einen verstärkten Zelltod der Krebsstammzellen, sondern vielmehr auf eine durch Tanespimycin bewirkte Differenzierung derselben zurückzuführen. Diese spiegelte sich auch in einer verminderten Expression von Pluripotenzmarkern auf mRNA-Ebene im Vergleich zur alleinigen Cisplatin-Behandlung wider. Somit präsentierte sich Tanespimycin als potenter Inhibitor von Krebsstammzellen. Auch wenn weitere vorklinische und klinische Tests und Untersuchungen erfolgen müssen, stellt Tanespimycin bzw. die Substanzklasse der HSP90-Inhibitoren einen interessanten und vielversprechenden Kandidaten für eine Ergänzung der Standardtherapie vor allem bei behandlungsresistenten und rekurrenten High-Risk-Hepatoblastomen dar.
• Hepatoblastoma is an embryonal liver tumour whose cells show different immature stages. Due to this immaturity, it is difficult to identify cancer stem cells, which are suspected to be present in this tumour and responsible for relapses. In preliminary experiments, a cancer stem cell population could be detected with the combination of the haematopoietic stem cell markers CD90 and CD34 and the "oval cell" OV-6 antibody in the established hepatoblastoma cell lines HuH6 and HepG2. These CD34+OV-6+CD90+ cells showed increased expression of pluripotency factors and were characterised by increased migration behaviour. In the work presented here, tumour spheres assays were first performed to confirm this population as cancer stem cells, as only cancer stem cells are able to grow under the given circumstances. These cells could differentiate again in "normal media". Furthermore, the cell lines were treated with the standard therapeutic agent cisplatin. Since cancer stem cells are considered chemoresistant, an enrichment of CD34+OV-6+CD90+ cells was also observed in the surviving cell population. In addition, another CD34+OV-6+CD90+ population could be identified. Its expression of all three markers was lower and constituted the majority of the CD34+OV-6+CD90+ population at increasing cisplatin concentrations. In addition to the increased transcript levels of the pluripotency markers Oct4 and Nanog, the CD34+OV-6+CD90+ cancer stem cells were characterised by increased expression of the activation-induced cytidine deaminase AID. This factor has an inducing effect on the transcription of both pluripotency markers. It may therefore play a role in the induction of pluripotency and its long-term maintenance in cancer stem cells as well. Also, the reduced transcript levels of pluripotency genes after AID siRNA knock-down suggested a dependency of stem cell character on this factor. To investigate an effect of therapeutics on cancer stem cells that inhibit AID, the cells were treated with the DNMT inhibitors decitabine and zebularine and the HSP90 inhibitor tanespimycin. In fact, a reduced proportion of the cancer stem cell population was observed in the HuH6 cells as a result of the three agents. However, when the cells were subsequently treated with the standard cytostatic drug cisplatin, pre-treatment with zebularine or decitabine led to a strong accumulation of cancer stem cells. This was mainly due to cells with the lower positive CD34+OV-6+CD90+ expression profile, which seem to be chemo-induced. Although the majority of tumour cells appear to be eliminated, these results suggest the formation of chemo-induced cancer stem cells that may be responsible for relapse in the long term and thus, speaking clearly against a therapy with these agents. In contrast, pre-treatment with tanespimycin was effective in reducing the proportion of cancer stem cells compared to cisplatin treatment alone. Interestingly, this was not due to increased cell death of the cancer stem cells, but rather to a differentiation caused by tanespimycin. This was also reflected in the reduced expression of pluripotency markers compared to cisplatin treatment alone. Therefore, tanespimycin seems to represent as a potent inhibitor of cancer stem cells. Even if further preclinical and clinical tests and investigations have to be performed, tanespimycin and the substance class of HSP9 inhibitors represent interesting and promising candidates for supplementing standard therapy, especially in treatment-resistant and recurrent high-risk hepatoblastomas.