Electrogenic substrate binding to the Na +/proline transporter of E. coli

  • The Na+/proline transporter of E. Coli (PutP) is responsible for the uptake of proline which is subsequently used not only as a carbon and nitrogen source and a constituent of proteins but also as a particularly effective osmoprotectant. However, for a long time there was little known about the single steps in the reaction cycle of this transporter and only few details about its structure-function relationship are available. Aim of the present work was to achieve a deeper understanding about the kinetic properties of the Na+/proline transporter and to get insights into the structure-function relationship of the substrate binding. To answer these questions different techniques were used. By using the novel SSM technique combining the preparation of PutP proteoliposomes it was possible to demonstrate for the first time the electrogenic substrate binding to PutP transporter. Due to rapid solution exchange measurements on the SSM it was additionally possible to obtain time resolved information about the kinetic details of the cytoplasmic substrate binding sites which were not available by previous steady state and equilibrium binding measurements. Pre-steady-state charge translocation was observed after rapid addition of one or both of the cosubstrates Na+ and/or proline to the PutP-WT proteoliposomes adsorbed on the SSM. Thereby it was possible to link the observed electrical signals with the binding activity of PutP. The observed Na+ and/or proline induced charge displacement were assigned to an electrogenic Na+ and/or proline binding process at the cytoplasmic face of the enzyme with a rate constant of k > 50 s-1 proceeding the rate limiting step of the reaction cycle. Furthermore, based on the kinetic analysis of the electrical signals obtained from the measurements of PutP on SSM, the following characteristics of the substrates binding in PutP were deduced: (1) both Na+ and proline can bind individually to the transporter. Under physiological conditions, an ordered binding mechanism prevails; while at sufficiently high concentrations, each substrate can bind in the absence of the other; (2) substrate binding is electrogenic not only for Na+, but also for the uncharged cosubstrate proline. The charge displacement associated with Na+ binding and proline binding is of comparable size and independent of the presence of the respective cosubstrate. In addition, it was concluded that Na+ accesses its binding site through a high-field access channel resulting in a charge translocation, whereas the binding of the electroneutral proline induces a conformation alteration involving the displacement of charged amino acid residue(s) of the protein; (3) Na+ and proline binding sites interact cooperatively with each other by increasing the affinity and/or the speed of binding of the respective cosubstrate; (4) proline binding proceeds in a two step process: low affinity (~ 0.9 mM) electroneutral substrate binding followed by a nearly irreversible electrogenic conformational transition; (5) membrane impermeable PCMBS inhibits both Na+ and proline binding to the inside-out orientated PutP transporter, indicating that rather than selectively blocking a specific binding site, PCMBS probably locks the enzyme in an inactive state. The possible targets for this SH-reagent are cysteines 281 and 344 located close to the cytoplasmic surface of the protein. Beyond it, transient electrical currents of PutP were also observed on the BLM after rapid addition of proline in the presence of Na+. This was possible by combining the conventional BLM technique with high-speed flash-photolysis of caged-proline. Indeed the signals on the BLM indicate the detection of a different underlying reaction process in comparison to the data achieved by the SSM technique. This has paved the way for supplemental information about the reaction cycle since it was possible to assign the flash-photolysis BLM signals to the proline binding step followed by the internalization of Na+ and proline into the liposome. Thereby it was found, that the presence of Na+ is indispensable and the time constant for the process is ~ 63 ms. Moreover, structure-function information about the Na+ and proline binding sites of PutP was obtained by investigating the functionally important amino acid residues Asp55, Gly63 and Asp187 with site-directed mutagenesis and the combined SSM technique. One finding is that the mutated proteins PutP-D55C and PutP-G63C showed no activity on the SSM. Therefore, it can be assumed that either both Asp55 and Gly63 are crucial for the structure of PutP protein, or they are located at or close to the Na+ and proline binding sites. Furthermore, the results obtained from PutP-D187N and PutP-D187C mutants on SSM suggest that Asp187 of PutP is likely to be involved in the Na+ binding at the cytoplasmic side of the backward running carrier. Taken together the results of the present work have substantially broadened the known picture of the Na+/proline transporter PutP thereby several steps of the reaction cycle were elucidated, and moreover, valuable insights into the structure-function relationship of the transporter have become available.
  • Der Stofftranport über die zytoplasmische Membran von Pro- und Eukaryotischen Zellen wird durch eine Vielzahl verschiedener Transportmechanismen gewährleistet. Unter diesen ist der sogenannte Na+/Substrat Symport, der durch Mitglieder der „Solute:Na+Symporter“ Familie vermittel wird, ein besonders wichtiger Mechanimus (siehe auch 1.1.3, 1.1.5 und 1.1.6). Trotz seiner Bedeutung wurde bisher nur ein Vertreter dieser Protein-Familie, der Na+/Proline Transporter von E. coli (PutP), relativ umfangreich charakterisiert. Auch aus diesem Grund stellt PutP das bevorzugte Modellsystem dar, um den Mechanismus desNa+/Substrat Symport auf molekularen Niveau aufzuklären (Hanada et al., 1992; Jung, 2001a; siehe auch 1.2). Die zellphysiologische Bedeutung von PutP liegt in der zellulären Aufnahme von Prolin, das der Zelle nicht nur als Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff, sondern von dieser auch als grundlegender Baustein zum Aufbau von Proteinen benötigt wird. Darüberhinaus hat Prolin eine wichtige Funktion als besonders effektives Osmoprotektant. Trotz einer Vielzahl von Studien sind bisher nur relativ wenige Informationen über die Struktur-Funktions Beziehung von PutP verfügbar. Auch über die während des Reaktionszyklus ablaufenden Einzelprozesse liegen bis heute keine Erkenntnisse vor. Die offenen Fragen zur Reaktionskinetik des Na+/Prolin Symports lassen sich wie folgt formulieren: (1) Wie binden Na+ und Prolin an das Protein und wie werden diese transportiert? Wie schnell sind diese Reaktionen? (2) Welche Schritte im Reaktionszyklus sind geschwindigkeitsbestimmend? (3) Sind Bindungs- und Transportprozesse elektrogen? (4) Falls sie elektrogen sind, welche Ursachen hat der Ladungstransport? Eine weitere wichtige Frage lautet: (5) gibt es spezifische Inhibitoren für das Protein und welche Effekte haben sie auf die Aktivität? Das Ziel der vorliegenden Studie lag daher darin zur Aufklärung dieser offenen Fragestellungen beizutragen. Darüberhinaus sollte auch ein detailliertes Verständnis der Struktur-Funktions Beziehung der im Transportprozeß stattfindenden Substrat-Bindung gewonnen werden. Um diese komplexen Fragestellungen zu beantworten, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit unterschiedliche biophysikalische Messtechniken eingesetzt. Aufgrund der geringen Größe von E. coli Bakterien (siehe 1.3) konnten allerdings keine konventionellen elektrophysiologischen Methoden angewandt werden. Diese die Charakterisierung erschwerende Problematik konnte aber durch den Einsatz der solid supported membrane (SSM) und der black lipid membrane (BLM) Technik bewältigt werden. Ein wichtiges Ergebnis der im Rahmen dieser Arbiet durchgeführten Messungen ist, daß zum ersten Mal die elektrogene Substrat-Bindung des PutP Transporters gezeigt werden konnte.Aus den vorliegenden experimentellen Erkenntnissen ließen sich zusätzlich Informationen über die kinetischen Details der zytoplasmischen Substrat-Bindung ableiten. Diese Erkenntnisse vermittelten eine neue Qualität im Verständnis des Transportproßes des PutP Transporters, die aus in der Literatur beschriebenen „steady-state“-Studien und Gleichgewichts-Bindungs-Studien nicht gewonnen werden konnten. In weiteren Experimenten konnten nach schneller Zugabe von einem der beiden Ko-Substrate Na+ und/oder Prolin zu den an der SSM absorbierten PutP-WT Proteoliposomen Vorgleichgewichts-Ladungsverschiebungen beobachtet werden. Dabei ermöglichte die genaue Analyse der dabei beobachteten elektrischen Signale diese im Rahmen der Bindungsaktivität von PutP zu interpretieren. Die beobachtete Na+ und/oder Prolin induzierte Ladungsverschiebung konnte dem elektrogenen Na+ und/oder Prolin Bindungsprozess an der zytoplasmischen Seite des Enzyms mit einer Ratenkonstante von k > 50 s-1 zugeordnet werden. Dabei ging aus den Daten hervor, daß diese Reaktion dem ratenlimitierenden Schritt des Zykluses vorangeht. ...

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Metadaten
Author:Aihua Zhou
URN:urn:nbn:de:hebis:30-31749
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Ernst Bamberg, Bernd Ludwig
Advisor:Klaus Fendler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/09/29
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/01/02
Release Date:2006/09/29
Page Number:110
First Page:1
Last Page:105
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:349836779
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Sammlung Biologie / Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
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