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Ha Vy Hoang-Do Truoc

• Sowohl Menschen und Tiere als auch Pflanzen haben im Laufe der Evolution innere Uhren entwickelt, die dem Körper auch in Abwesenheit äußerer Einflüsse Zeitinformationen liefern. Unter diesen ist die endogene Tageszeitenuhr durch die Steuerung eines Rhythmus von Ruhe und Aktivität, von Schlaf- und Wachzustand charakterisiert. Da diese Uhr unter konstanten Bedingungen nicht einem exakten 24h-Rhythmus unterliegt, werden Zyklen, die unter der Kontrolle dieser Uhr stehen, als circadiane Rhythmen bezeichnet; sie stellen eine fundamentale Adaptation des Organismus an den physikalischenTag-Nacht-Wechsel dar, die auch bei geringen diurnal-nocturalen Unterschieden persistiert. Gesteuert werden diese Zyklen über eine übergeordnete circadiane „Master-Clock“, die sich bei Säugern im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des Hypothalamus befindet. Da die Periodendauer des circadianen, endogen generierten Rhythmus von einem 24h-Rhythmus abweicht, muss die endogene Uhr durch das Tageslicht nachgestellt werden, d.h. mit der tatsächlichen Tageszeit synchronisiert werden. Neben dem Beleuchtungszyklus hat auch der Schlaf einen stabilisierenden Einfluss auf den im SCN generierten circadianen Rhythmus. Für die Funktion der inneren Uhr ist die rhythmische Expression sogenannter Uhrengene verantwortlich. Die Uhrengenprodukte bilden interagierende transkriptionell-translationale Rückkoppelungsschleifen, die eine Periodenlänge des Syntheseablaufs von 24 Stunden besitzen. Ein heterodimerer Komplex, der aus den beiden Transkriptionsfaktoren CLOCK und BMAL1 aus der bHLH-PAS-Familie besteht, aktiviert über ein hochspezifisches E-Box- Promotorelement die Transkription der Uhrengene per1-3, cry1-2 und rev-erbα. Unter dieser Aktivierung häufen sich die Uhrengenprodukte PER und CRY im SCN an, bis am Ende des circadianen Tages der Gipfel erreicht wird. Eine negative Rückkoppelung kommt zum Zuge, indem die Proteine CRY und PER zusammen mit der Caseinkinase Iε (CKIε) einen heterotrimeren Komplex bilden, der im Zellkern die CLOCK-BMAL1-abhängige Transkription blockiert. Schlaf als prominenter rhythmischer Prozess, der vom SCN gesteuert wird, dient gleichzeitig zur Erholung des gesamten Organismus (genaue Funktionen immer noch unbekannt). Insofern ist es interessant zu erforschen, wie der SCN auf Schlafentzug reagiert. Bei Goldhamstern wurde die Beeinflussung von Schlafentzug auf die Uhrengenprodukte im SCN untersucht. Dabei wurden die Veränderungen der Proteine CLOCK, BMAL1, PER1-3 und CRY1-2 direkt nach dem Schlafentzug und während des Tagesganges analysiert. Mit immuncytochemischer Technik wurde in einem ersten Schritt nachgewiesen, dass ein 2- stündiger Schlafentzug direkte Auswirkungen auf CLOCK, BMAL1, PER1 und CRY1 im SCN des Goldhamsters besitzt. Um diese Auswirkungen besser zu deuten, wurde der Schlafentzug auf 3 Stunden erhöht, und die Proteinkonzentrationen im SCN in regelmäßigen Abständen über den ganzen Tag beobachtet. Von allen untersuchten Uhrengenprodukten wiesen BMAL1, PER1-2 und CRY1 die stärksten Unterschiede zu den Kontrolltieren auf. Die BMAL1 Immunreaktitivtät war nach Schlafentzug gesenkt. PER1, PER2 und CRY1 reagierten über eine Hochregulierung ihrer Proteine im SCN direkt nach dem Schlafentzug, die zu einer Phasenvorverschiebung führte. Dabei war der Gehalt von PER2 schneller erhöht als der von PER1. Die Uhrengene per1 und per2 spielen eine prominente Rolle bei der Anpassung des endogenen Rhythmus an die exogenen Beleuchtungsverhältnisse und antworten auf synchronisierende Lichtimpulse durch eine Hochregulation ihrer Transkription, weshalb sie zu den immediate early genes gehören. Daraus kann die Hypothese hergeleitet werden, dass auch Schlafentzug, da die Hamster im Licht wach gehalten wurden, zu demselben Synchronisationsverhalten des SCN führt, wie ein kurzer Lichtstimulus. Der BMAL1-Gehalt verringerte sich direkt nach Schlafentzug, der den antiphasischen Verlauf des Expressionsmusters von BMAL1 und PER2 widerspiegelt. Eine Hochregulation des BMAL1- Gehaltes während des Tages spricht dafür, dass ein initial hoher Gehalt von PER2 über eine Supprimierung von REV-ERBα zu einer Enthemmung der Inhibition von BMAL1 führte. Da REV-ERBα die Expression von CRY1 hemmt, dieses wiederum durch PER2 in seiner Expression gehemmt wird, hat ein erhöhter PER2-Gehalt auch einen erhöhten CRY1-Gehalt zur Folge. Der CLOCK-Gehalt im SCN, der auch unter normalen Bedingungen stabil bleibt, schwankte unwesentlich im Laufe des Tages nach Schlafentzug. Dies spiegelt seine nur geringfügige Bedeutung in der Synchronisation des Hauptoszillators wider. Zum letzten Messungszeitpunkt, d.h. in der Mitte der Dunkelphase, ähnelten sich die Proteingehalte von Versuchstieren und Kontrolltieren, woraus man schließen kann, dass die Auswirkungen des Schlafentzugs durch den SCN im Laufe einer Tagesperiode von 24 h wieder kompensiert werden können.
• During evolution cell living organisms developed an endogenous clock regulating internal rhythms in absence of external stimuli. The cycle created by the endogenous clock differs only slightly from the 24-hour solar cycle; therefore, it is described as circadian rhythm. The circadian rhythm can be entrained to synchronize to an exogenous cycle by external cues called Zeitgeber. Daylight as an external stimulus was shown to synchronize the circadian rhythm with the physical light/dark cycle. To maintain the synchrony of the endogenous and exogenous cycle, the synchronization process induces changes in the concentrations of the molecular components CLOCK, BMAL1, PER1-3 and CRY1-2 during a 24-hour cycle. Disruptions of rhythm usually cause adversive effects in the organism. Disorders, i.e. sleep deprivation, are correlated with irregular functions of the circadian rhythm. In mammals, these cycles are controlled by a superior circadian “master clock”, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN). The genetic backbone of the clock complex consists of clock genes that are expressed rhythmically. Clock proteins form a transcription-translation regulatory loop with positive and negative feedback controls. The activating elements of the mammalian clock are the transcription factors CLOCK and BMAL1 (bHLH/PAS-family). As heterodimeric complex, these factors act via E-box regulatory sequences on their target genes, activating the transcription of PER1-3, CRY1-2 and REV-ERBα. The levels of PER and CRY accumulate in the SCN to peak levels at the end of circadian day. The next circadian cycle is initiated with the formation of a complex containing the proteins PER and CRY together with casein-kinase 1ε (CK1ε) which blocks the CLOCK and BMAL1 transcription. These steps establish a negative feedback loop that constitutes the core of the oscillator. One clock-gene cycle lasts approximately 24 hours, thus, causing the circadian clock to run. Sleep is a prominent rhythmical process controlled by the SCN; it is essential to human health. In this study, the reactivity of clock genes was analyzed in the SCN with respect to sleep deprivation in golden hamsters. By the use of immunocytochemistry (ICC), changes in expression of CLOCK, BMAL1, PER1-3 and CRY1-2 were examined directly after sleep deprivation and during the diurnal light phase. Measurements of the immunoreactivity were observed in the SCN over the whole day in defined intervals. Golden hamsters that were deprived from sleep for 2 or 3 hours displayed distinct difference in the reactivity of BMAL1, PER1-2 and CRY1 as compared to the control group, whereas the CLOCK reactivity did not change rhythmically during the diurnal cycle. Examined directly after sleep deprivation, BMAL1 showed a decrease, PER1, PER2 and CRY1 showed a rapid rise in immunoreactivity. The reactivity of PER2 was higher then that of PER1. The clock genes per1 and per2 play an important role in adapting the endogenous rhythms to the exogenous light stimuli, since the respective mRNA is expressed immediately after light exposure. For this reason, these genes belong to the immediately early genes (IEGs). Based on the characteristics of these IEGs it can be hypothesised that both sleep deprivation and short light exposure cause identical effects; sleep deprivation can be regarded as a long light impulse. The BMAL1 concentrations decreased immediately after sleep deprivation, whereas PER2 concentrations increased. This reflects the anti-phase expression of BMAL1 and PER2. The increased expression of PER2 after sleep deprvation causes the suppression of the expression of REV-ERBα. Since REV-ERBα is an inhibitor of the CRY1 expression, the latter is increased if REV-ERBα is missing. With a specific delay, high PER2 and CRY1 levels induce the upregulation of BMAL1. Analysis performed in the middle of the night, displayed similar levels of clock proteins in sleep deprived hamsters and in control animals. This is suggestive of the ability of the SCN to compensate the influence of sleep deprivation for 2 or 3 hours during only one 24-hour cycle.