Structural and functional characterization of the rotor rings from a Fusobacterium F-type and a Burkholderia N-type rotary ATPase

  • Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same. All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi. The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism. The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding. In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases. The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings. A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4). We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
  • Der Hauptanteil des universellen zellulären Energieüberträgers Adenosintriphosphat (ATP) wird durch membrangebundende Enzymkomplexe, die sogenannten F1Fo ATP Synthasen, bereitgestellt. Dieser Komplex besteht in seiner einfachsten Form aus acht strukturellen Komponenten, die in unterschiedlichen Stöchiometrien vorliegen. Die Synthese von ATP ist enweder an den Transport von Protonen (H+) oder Natriumionen (Na+) über eine Membran gekoppelt. Ein solches Ion erreicht die rotierende Untereinheit des Proteinkomplexes, den Rotor (c-) Ring, von einer Seite der Membran, wird fest daran gebunden und nach einer fast vollständigen Umdrehung auf der anderen Seite der Membran wieder entlassen. Diese Rotation wird über den zentralen Schaft des Enzyms weiter in den katalytisch aktiven Bereich geleitet wo aus ADP und Pi schließlich ATP gebildet wird. Das Verhältnis von transportieren Ionen zu synthetisierten ATP Molekülen wird durch die Anzahl an Untereinheiten bestimmt, aus dem der Rotor Ring aufgebaut ist. Während aus einem vollständigen Zyklus jeweils drei Moleküle ATP resultieren, werden der Stöchiometrie entsprechend viele Ionen bewegt. Heute ist bekannt, dass die Stöchiometrie eine konstante Größe innerhalb einer Spezies ist wohingegen sie zwischen verschiedenen Organismen variieren kann und zwar soweit bisher beschrieben zwischen 8 und 15 c Untereinheiten. Einige hoch auflösende Röntgenstrukturen von c-Ringen geben desweiteren Einblick in die Koordination des zu transportierenden Ions, entweder ein H+ oder ein Na+, wobei hervor geht, dass die Na+- Koordination strukturell anspruchsvoller ist als die H+-Bindung. In dieser Arbeit wurde der Rotor Ring der F1Fo ATP Synthase des opportunistisch pathogenen Bakteriums Fusobacterium nucleatum auf funktionaler und struktureller Ebene untersucht. Dazu wurde der Ring heterolog innerhalb einer hybriden ATP Synthase in E. coli produziert und anschließend daraus gereingt. Sowohl biochemische Experimente des isolierten Rings als auch zwei erhaltene hoch auflösende Röntgenstrukturen bei verschiedenen pH Werten haben gezeigt, dass es sich um einen c11 Ring handelt, der ein Na+ in einer bisher unbeschriebenen Weise koordiniert. Im Unterschied zu der bereits zuvor gelösten Na+ sspezifischen c-Ring Struktur liegt hier ein zweiter Glutamatrest innerhalb der Ionenbindestelle vor, zusätzlich zu dem hoch konservierten Glutamat (oder Aspartat), das in allen c-Ringen existiert. Ergänzende computergestützte Analysen haben gezeigt, dass dieses zweite Glutamat konstitutiv protoniert vorliegt, um die ansonsten entstehende negative Ladung des Glutamats in der Bindestelle zu kompensieren. Simulationen über einen offenen Zustand des konservierten Glutamats, wie zum Zeitpunkt wenn das Na+ entlassen wird, legen dar, dass das gebundene H+ nicht mit entlassen wird, sondern einen festen strukturellen Bestandteil innerhalb der Bindestelle ausmacht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neu eingeführte Untergruppe von ATPasen, die sogenannte N-typ ATPase, untersucht. Bioinformatische Studien postulierten, dass diese Untergruppe als Ergänzung zu den oben genannten F-typ ATP Synthasen in einigen Bakterien und Archaen vorliegt und im Gegensatz zu diesen als ATP betriebene Ionenpumpe arbeitet. Wir konnten zeigen, dass das Enzym tatsächlich in bakteriellen Zellen vorkommt. Desweiteren wurde der N-ATPase Rotor Ring des pathogenen Bakteriums Burkholderia pseudomallei heterolog in E. coli produziert und gereinigt. Biochemische Analysen des isolierten c-Rings deuten auf eine H+- Spezifität des Proteins hin. Daneben wurden breits dreidimensionale Proteinkristalle des Rings erhalten und Röntgenstrukturexperimente damit durchgeführt, die als Optimierungsgrundlage zur Strukturbestimmung des Komplexes dienen können. Eine Einzelpartikel-Analyse des isolierten Proteins mittels Elektronen Kryo-Mikroskopie wurde durchgeführt und erzielte bis zu dem Stand dieser Arbeit zweidimensionale Daten über den c-Ring, die eine bisher unbekannte Stöchiometrie mit 17 identischen c Untereinheiten andeuten. Drei Datensätze des Proteins in verschiedenen amphiphatischen Molekülen (Amphipol A8-35, n-dodecyl--Dmaltoside, DDM und Lauryldimethylamine-N-Oxide, LDAO) wurden aufgenommen und bearbeitet und anschließend miteinander verglichen. Diese Ergebnisse können für zukünftige Untersuchungen an sehr kleinen Membranproteinen, wie dem c-Ring, mittels Einzelpartikel Elektronen Kryo-Mikroskopie von großer Bedeutung sein, da das hier betrachtete Objekt das kleinste darstellt, dessen Struktur jemals auf diesem Wege gelöst wurde. Die dreidimensionale Strukturbestimmung des Komplexes wird derzeit fortgesetzt, um detailliertere strukturelle Informationen über den N-ATPase c-Ring zu erhalten und dessen Stöchiometrie zu bestätigen.

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Metadaten
Author:Sarah Schulz
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-391822
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Klaas Martinus PosORCiD, Werner Kühlbrandt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2016/02/29
Year of first Publication:2015
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2016/01/25
Release Date:2016/02/29
Page Number:271
HeBIS-PPN:371396484
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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