Open Access

Julian Martinus de Mos

• It was previously shown for the Escherichia coli diacylglycerol kinase (DgkA) that enzyme-reactions at the membrane interface can be monitored by solid-state NMR. However, such studies can face problems due to limited accessibility of the active sites: Natural substrates for membrane enzymes, but also ligands for membrane proteins or lipid mediators, are either partitioning into the membrane and cannot be added easily, or if soluble exhibit accessibility restrictions, as they cannot freely pass through lipid bilayers. This situation complicates quantitative kinetic analysis of biochemical processes such as enzyme activity, ligand binding, but also oligomerization or folding reactions in the membrane or at its interface under MAS NMR conditions. To overcome these limitations the feasibility and possible advantages of the uncaging approach as a new tool for biomolecular solid-state NMR to trigger reactions by light have been explored. DgkA’s enzymatic activity, exemplary of a biochemical process on the membrane interface, was thereby triggered in situ during MAS by light-induced release of its substrates that were rendered inactive with photolabile protecting groups. To be capable of uncaging sufficient amounts of substrate during MAS to follow the enzymatic reaction via 31P real-time NMR measurements, several illumination variants including an existing illumination setup to study retinal proteins under cryogenic conditions via DNP enhanced NMR were tested. As uncaging of micromole amounts of substrates requires a higher flux compared to initiation of a photocycle in retinal proteins, a new illumination setup was built with Bruker Biospin and Leoni Fibertech. It consists of a modified MAS probe and a suitable fiber bundle, allowing to efficiently couple light from high power LEDs into a sapphire rotor containing the sample, without disturbing the magnetic field homogeneity or sample rotation. By reducing the sample volume to the illuminated area up to 60 mM ATP were released by uncaging NPE ATP to initiate DgkA’s activity in several tested membrane mimetics. These mimetics included liposomes and bicelles, which are well established in the field of biomolecular solid state NMR as well as the optically transparent lipidic cubic phase of monoolein, widely used in membrane protein crystallography, but not yet well characterized as membrane mimetic under MAS conditions. A unique and powerful but compared to time and spatial resolution often underrepresented advantage of the uncaging approach for biophysical studies has been demonstrated by successful uncaging of a non-miscible lipid substrate to trigger DgkA’s kinase reaction: Initiation of processes that cannot easily be triggered by mixing. Examples of these are reactions involving highly hydrophobic, membrane partitioning compounds including lipid substrates, ligands or interaction partners, but also oligomerization or folding of biomacromolecules. The herein performed experiments therefore serve as a first demonstration of the uncaging approach’s feasibility and compatibility with a wide variety of membrane mimetics and give a first indication of its potential for a variety of biomolecular solid state NMR experiments. As high accessibility for solutes has been a second focus for the choice of membrane mimetics, DgkA’s activity in the lipidic cubic phases of monoacylglycerols with its two continuous networks of water channels has been further characterized. Kinetic parameters obtained from 31P real time solid state NMR experiments revealed that DgkA’s activity is similar to activities obtained in swollen cubic phases in a bath solution with wider water channels. Diffusion of ATP in a non swollen cubic phase was however strongly reduced compared to ATP in solution as diffusion measurements showed. Therefore, saturation of the enzyme required distinctly higher ATP concentrations. These results thereby underline the advantage of a non invasive and label free method like NMR to directly gain information about enzymatic reactions of immobilized enzymes in porous materials. The obtained wealth of information from 31P real time NMR experiments and biochemical assays in different membrane mimetics in presence and absence of lipid substrates and activators also provided further insight into DgkA’s enzymatic activity. It confirms ATP binding and hydrolysis in the absence of a lipid substrate, in agreement with the proposed mode of substrate binding, and allowed to estimate the in vivo relevance of previously observed ATPase activity in liposomes. Further exploration of the cubic phase as membrane mimetic for protein solid state NMR revealed its high stability under MAS at elevated temperatures and capacity to reconstitute sufficient amounts of DgkA. Unlike monoolein, DgkA was cross-polarizable in a cubic phase and exhibited similar dynamics compared to DgkA reconstituted into liposomes, allowing to acquire the herein shown dipolar coupling based 2D protein spectra. As lipidic cubic phases are not containing phospholipids, monoacylglycerols could be especially useful as membrane mimetics for 31P correlation spectra. Initial experiments under DNP conditions, where in liposomes line broadening causes severe overlap of phospholipid signals and unspecific cross polarization highlight this aspect. In summary, herein reported results of the experiments performed with lipidic cubic phases demonstrate that they are robust and versatile membrane mimetics. They could be of advantage for a variety of solid-state NMR experiments where either optical transparency for efficient illumination is desired, accessibility for solutes and membrane components under MAS is required, or interference of phosphorous signals of other membrane mimetics must be avoided. In the second chapter of this thesis 1H solid-state NMR as a label free method to probe membrane order and dynamics directly within a cellular and disease relevant context was used to observe the effects of soluble epoxide hydrolase (sEH) encoding gene knock-outs on membrane dynamics. Knock-out of the sEH encoding gene changed the overall membrane dynamics in the physiological temperature range of native membranes derived from mouse brains, making the bulk membrane more dynamic. To confirm that these effects are related to the enzymatic activity of sEH, substrates and products of sEH were added to evaluate their effects on membrane dynamics. 19,20 dihydroxydocosapentaenoic acid (DHDP), a product of sEH, partially reversed the knock out phenotype in a concentration dependent manner whereas the substrate 19,20 epoxydocosapentaenoic acid did not cause any effects. As both polyunsaturated fatty acids did not show differences in phase behavior in a simple phospholipid bilayer these results provide evidence that the previously observed concentration dependent DHDP induced relocation of cholesterol away from detergent resistant lipid raft fractions is associated with alteration of membrane dynamics. Therefore, also the effect of cholesterol removal via cyclodextrin on membrane dynamics was analyzed. Removal of cholesterol led to a similar temperature profile of wild type and knock out membranes thereby supporting the hypothesis that DHDP induced relocation of cholesterol is causing altered membrane dynamics. These alterations have been shown by the lead authors of the collaborative research project to induce relocation of various membrane proteins and are involved in the development of diabetic retinopathy. Furthermore, in this context inhibition of sEH has been shown to inhibit diabetic retinopathy and proposed as target for prevention of one of the leading causes of blindness in the developed world.
• Wie in einer vorangegangenen Arbeit am Beispiel der Escherichia coli Diacylglycerinkinase (DgkA) gezeigt, können enzymatisch katalisierte Reaktionen an der Grenzfläche zwischen Lösung und biologischen Membranen mittels Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie (NMR-Spektroskopie) verfolgt werden. Solche Studien können jedoch aufgrund eingeschränkter Zugänglichkeit der Substrate zu den aktiven Zentren unter In vitro Bedingungen mit verschiedenen Problemen konfrontiert sein. Membranständige Substrate für Membranenzyme, aber auch Liganden für Membranproteine oder Lipidmediatoren, sind meist stark hydrophob und nicht wasserlöslich. Sie können daher nicht einfach hinzugegeben werden, was die Initiation solcher Reaktionen erschwert. Lösliche Substrate wiederum sind oftmals in ihrer freien Diffusion gestört, da sie Lipiddoppelschichten nicht überwinden können, was ebenfalls die quantitative kinetische Analyse biochemischer Prozesse wie Enzymaktivität oder Ligandenbindung erschwert. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die Machbarkeit untersucht biochemische Reaktionen In-situ durch lichtinduzierte Abspaltung von photolabilen Schutzgruppen auszulösen. Dabei wurde der so genannte Uncaging Ansatz als neues Werkzeug für die Festkörper-NMR-Spektroskopie etabliert und mögliche Vorteile dieses Ansatzes zur Initiierung von biochemischen Prozessen aufgezeigt. Die enzymatische Aktivität von DgkA, beispielhaft für einen biochemischen Prozess an der Membrangrenzfläche, wurde dabei im Spektrometer unter MAS Bedingungen durch lichtinduzierte Freisetzung ihrer Substrate ausgelöst. Um ausreichende Mengen an Substrat unter MAS Bedingungen zur Verfolgung der enzymatischen Reaktion freisetzen zu können, wurden mehrere Beleuchtungsvarianten getestet und ein neuer Beleuchtungsaufbau entwickelt. In einem ersten Schritt wurde ATP durch Abspaltung einer photolabilen Schutzgruppe freigesetzt um die Aktivität von DgkA in mehreren getesteten Membranmimetika zu initiieren. Zu diesen Membranmimetika gehörten Liposomen und Bicellen sowie die optisch transparente lipidische kubische Phase von Monoolein, die häufig in der Membranproteinkristallographie verwendet wird, aber bisher nicht detailliert für ihre Eignung als Membranmimetikum für Festkörper-NMR Experimente charakterisiert wurde. Das in einem zweiten Schritt erfolgreich durchgeführte Entschützen eines bei der Herstellung von Liposomen eingefügten, nicht wasserlöslichen Lipidsubstrats zur Initiierung der Kinase-Reaktion von DgkA zeigt dabei einen sehr großen Vorteil des Unaging-Ansatzes für biophysikalische Studien auf: Die Möglichkeit der Induzierung von Prozessen, die nicht einfach durch Mischen ausgelöst werden können wie Reaktionen, an denen membranpartitionierende Stoffe beteiligt sind, aber auch Oligomerisierung oder Faltung von Biomakromolekülen. Da die Zugänglichkeit von löslichen Stoffen und Verhinderung von Phasentrennung unter MAS für eine quantitative Untersuchung biochemischer Reaktionen mittels Festkörper NMR verbessert werden sollte, wurde die Aktivität von DgkA in den kubischen Lipidphasen von Monoacylglyceriden, weiter charakterisiert. 31P-Echtzeit-NMR-Experimente und biochemische Assays in verschiedenen Membranmimetika in Gegenwart und Abwesenheit von Lipidsubstraten und Aktivatoren lieferten dabei weitere Einblicke in die enzymatische Aktivität von DgkA. Sie bestätigten ATP-Bindung und Hydrolyse in Abwesenheit eines Lipidsubstrats und zeigen, dass Aktivatoren, wie Phospholipide nötig sind um effiziente ATP Bindung in Abwesenheit von Lipidsubstraten zu erzielen. Weitere Untersuchungen der kubischen Phase als Membranmimetikum für die Festkörper-NMR-Analyse von Proteinen ergaben eine hohe Stabilität unter MAS und die Fähigkeit, ausreichende Mengen an DgkA zu rekonstituieren. DgkA war im Gegensatz zu Monoolein in der kubischen Phase kreuzpolarisierbar und zeigte eine ähnliche Dynamik im Vergleich zu DgkA in Liposomen, wodurch auf dipolare Kopplungen basierende 2D Proteinspektren erhalten werden konnten. Da Monoacylglyceride keine Phosphorkerne enthalten, könnten sie insbesondere als Membranmimetika für 31P Korrelationsspektren nützlich sein. Erste Experimente unter DNP-Bedingungen, bei denen die Phospholipide der Liposomen weitere Signale durch unspezifische Kreuzpolarisation verursachen, unterstreichen diesen Aspekt. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit wurde 1H-Festkörper-NMR als markierungsfreie Methode zur Untersuchung der Membranordnung und -dynamik in einem zellulären und krankheitsrelevanten Kontext verwendet, um die Auswirkungen des Knock-outs der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) auf die Membrandynamik zu untersuchen. Knock-out des sEH kodierenden Gens in Mäusen erhöhte die allgemeine Membrandynamik im physiologischen Temperaturbereich von aus Mäusehirnen gewonnenen nativen Membranen. Um zu bestätigen, dass diese Effekte mit der enzymatischen Aktivität von sEH zusammenhängen, wurden Substrate und Produkte der sEH hinzugefügt, um ihre Auswirkungen auf die Membrandynamik zu analysieren. 19,20 Dihydroxydocosapentaensäure (DHDP), ein Produkt von sEH, kehrte den Phänotyp des Knock-outs um, während das korrespondierende Substrat keine Auswirkungen hatte. In einem nächsten Schritt wurde die Wirkung der Cholesterinentfernung über Zugabe von Cyclodextrin auf die Membrandynamik analysiert. Die Entfernung von Cholesterin führte zu einem ähnlichen Temperaturprofil von Wildtyp- und Knock-out-Membranen, was die Hypothese stützt, dass die durch DHDP induzierte Verlagerung von Cholesterin eine veränderte Membrandynamik verursacht. Eine Fülle von Ergebnissen, die von den Hauptautoren des viele weitere Forschungsdisziplinen umfassenden Projektes zusammengefasst wurden, zeigen dabei, dass erhöhte DHDP Level ein Risikofaktor für die Entwicklung der diabetischen Retinopathie, eine maßgeblich im Rahmen von Diabetes mellitus auftretende Schädigung der Retina, sind. Durch dieses Forschungsprojekt konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Reduktion der DHDP Konzentration durch Hemmung von sEH die Entwicklung der diabetischen Retinopathie hemmt und daher ein möglicher Angriffspunkt für die Prävention einer der häufigsten Erblindungsursachen in Europa und Nordamerika darstellt.