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Larissa Neidert

• Durch die weltweite Verbreitung von bakteriellen Resistenzgenen wie der Carbapenemase New-Delhi-Metallo-β-Laktamase (NDM), die nahezu alle Beta-Laktamantibiotika spalten kann, und die langwierige Entwicklung neuer Antibiotika, hat die Erforschung von Resistenzdeterminanten eine hohe Priorität. In der vorliegenden Arbeit wurde die neu entdeckte Variante NDM 16b unter epidemiologischen Gesichtspunkten, mit einem in vivo Infektionsmodell sowie die Interaktion von NDM-Varianten mit dem menschlichen Komplementsystem untersucht. Im ersten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Datenerhebung für 60 blaNDM tragende Patientenisolate des Zeitraums 2007 - 2017 auf Basis klinikinterner Datenbanken zu multiresistenten Erregern und zudem eine quantitative Empfindlichkeitstestung für 13 (Reserve-)Antibiotika. Es fiel eine kontinuierliche Zunahme an NDM-Isolaten und insbesondere von NDM-Varianten mit der Punktmutation M154L auf, da diese Mutation eine erhöhte Hydrolaseaktivität vermittelt. Deutlich erkennbar war eine Korrelation der M154L-Varianten und E. coli. Im Resistenzprofil der blaNDM-positiven Isolate zeigten sich hohe Resistenzraten (> 94%) gegen alle Beta-Laktam-Antibiotika und Fluorchinolone. Fosfomycin und Colistin waren in über 75% der Fälle noch wirksam. Im zweiten Teil wurden Infektionsversuche mit dem Modellorganismus Galleria mellonella (Larve der großen Wachsmotte) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NDM-Produktion der injizierten Erreger keinen Einfluss auf die Pathogenität hatte. Zudem konnte in Therapieversuchen mit Imipenem im lebenden Organismus gezeigt werden, dass über die bakterielle NDM-Produktion die Resistenz gegen Imipenem vermittelt wird. Im dritten Teil der Arbeit wurden die NDM-Varianten NDM 1Δ28, NDM 4Δ28 und NDM 16bΔ28 hinsichtlich ihres inhibitorischen Potentials auf Komplement untersucht. Mit den erzielten Ergebnissen der funktionellen Tests konnte für den klassischen und den Lektinweg eine signifikante Hemmung durch alle drei NDM Varianten nachgewiesen werden. Ein direkter Vergleich der einzelnen NDM-Varianten ergab, dass NDM 1Δ28 die stärkste und NDM 16bΔ28 die schwächste Inhibition auf den klassischen Komplementweg ausübte. Bindungsanalysen mit einzelnen Komplementkomponenten (C3, C3b, C3c, C4 und C4b) ließen auf eine Interaktion von NDM 1Δ28 mit C4b schließen. Zusammenfassend leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Fortführung epidemiologischer Untersuchungen von NDM Varianten und erbringt den in vivo Nachweis für Resistenzvermittlung durch NDM. Weiterhin wurde gezeigt, dass NDM neben der Carbapenemasefunktion auch eine immunmodulierende Wirkung erfüllt, indem der klassische und Lektinweg des Komplementsystems gehemmt wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass die globale Ausbreitung von NDM-produzierenden Erregern nicht nur durch die Vermittlung der Antibiotikaresistenz, sondern auch durch eine Immunevasion bedingt ist. Zukünftig könnte somit die Erforschung des Mechanismus der Immunevasion ebenso interessant sein wie die Suche nach wirksamen Inhibitoren der NDM.
• Due to worldwide emergence of New-Delhi Metallo-β-Lactamase (NDM), a carbapenemase able to hydrolyze nearly all Beta-Lactam antibiotics, and the lack of promising new antibiotics or inhibitors, research of resistance genes should be a high priority. In this thesis, the new variant NDM-16b was analyzed in an epidemiological context and by using an in vivo infection model. In addition, the interaction between NDM and human complement system was examined. At first, patient data from 2007 - 2017 were collected based on internal hospital databases for multi-resistant pathogens and more than 50 patient isolates harboring blaNDM were tested on their susceptibility to 13 (reserve) antibiotics. We found a continuous increase in the number of NDM-positive isolates, especially of NDM-variants containing the M154L-substitution, which leads to an increased hydrolytic activity. Moreover, a high number of M154L-substitutions in E. coli was noted. Susceptibility testing revealed high resistances (> 94%) against Beta Lactam antibiotics and fluoroquinolones, however, the tested isolates were mainly susceptible to Colistin and Fosfomycin (75%). In the second part, the new variant NDM-16b was analyzed using the G. mellonella (larvae of the greater wax moth) infection model, aiming to define lethal doses of pathogens producing NDM, as well as assessing therapy success with imipenem in vivo. We showed that resistance against carbapenems is mediated by NDM production. Lastly, we were able to demonstrate that NDM-production does not influence pathogenicity. The third part of this work focused on the interaction of variant NDM 1Δ28, NDM 4Δ28, and NDM 16bΔ28, respectively, with proteins of the complement system. By using functional tests, a significant inhibition of the classical pathway and the lectin pathway of the complement system was shown. By comparison, NDM 1Δ28 displayed the highest inhibitory capacity on the classical pathway while NDM 16bΔ28 showed a weak inhibition. Furthermore, binding analyses with different complement components (C3, C3c, C3b, C4 and C4b) clearly indicated an interaction of NDM 1Δ28 interacts with C4b. In summary, this work contributes to epidemiological studies concerning antibiotic resistance genes and NDM-variants, demonstrates the mediation of imipenem resistance through NDM-production in vivo. Furthermore, we showed that NDM fulfils two tasks: the carbapenemase activity and an immune-modulating effect. Certainly, both functions lead to the worldwide spread of multi-resistant isolates harboring blaNDM. In the future, it could be of high interest to describe the immune-escaping mechanisms as well as to search for potent NDM-inhibitors.