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Mitochondrial RNA granules (MRGs) are membraneless, highly specialized compartments that play an essential role in the post-transcriptional regulation of mitochondrial gene expression. This regulation is crucial for maintaining energy production, controlling metabolic functions and ensuring homeostasis in cells. Dysregulation of mitochondrial genes has been linked to various human diseases, including neurodegenerative and metabolic disorders as well as certain types of cancer.
MRGs are composed of different RNA species, including mitochondrial precursor RNA (pre-RNA), mature tRNAs, rRNAs and mRNAs complexed with multiple proteins involved in RNA processing and mitoribosome assembly. However, despite the significance of MRGs, their protein composition, structural organization, stability and dynamics during stress conditions remain elusive. In the study reported here, I adopted a three-step approach to address the aforementioned fundamental issues.
First and foremost, I identified the protein composition of MRGs and unveiled their architectural complexity. To characterize the MRG proteome, I applied the cutting-edge TurboID-based proximity labeling approach combined with quantitative mass spectrometry. Proximity labeling was conducted on 20 distinct MRG-associated human proteins, resulting in the identification of more than 1,700 protein-protein interactions. This expansive dataset enabled me to create a comprehensive network, providing valuable insights into both the (sub)architecture as well as the core structure of MRGs in-depth.
Secondly, I investigated the spatio-temporal dynamics of MRGs under various mitochondrial stress conditions. To monitor the morphological alterations and compositional changes of MRGs, I utilized time-resolved confocal fluorescence microscopy and proteomics, respectively. In this analysis, I applied IMT1, the first specific inhibitor that selectively targets mitochondrial transcription. Using this methodology, I pinpointed precise conditions that triggered MRGs’ disassembly during stress, followed by their reassembly when nascent RNA production was restored. The results of this examination elucidate that MRGs are highly dynamic and stress adaptive structures, capable of rapid dissolution and reassembly, a process closely connected to mitochondrial transcription.
Thirdly, I aimed to explore the impact of RNA turnover on MRGs’ integrity during stress, employing confocal fluorescence microscopy and quantitative real-time PCR. I observed that depletion of MRG proteins associated with RNA degradation counteracts MRGs’ disassembly under stress conditions, a phenomenon attributed to the accumulation of double-stranded RNA (dsRNA). These results emphasize the critical role of pre-RNA turnover in maintaining MRG integrity and reveal that MRGs can be stabilized by dsRNA.
Taken together, the comprehensive investigation reported in this thesis has substantially broadened and deepened our understanding of MRGs’ complexity. By identifying their molecular structure and dynamics, I have gained significant insights into the fundamental characteristics and biological functions of MRGs in cellular processes. This knowledge contributes to the identification of disease-related pathways linked to mitochondrial gene expression and may inspire future studies to develop novel therapeutic approaches.
Inflammation is a crucial host defense mechanism activated in response to injury or infection. Its primary goal is to eliminate the source of the disturbance, repair the damaged tissue, and restore homeostasis. Inflammatory processes can be recognized through increased blood flow, higher vascular permeability, and the recruitment of leukocytes and plasma proteins to the tissue. A pathogen-induced inflammation triggers various pro- and anti-inflammatory processes. Local tissue cells and Toll-like receptors call upon innate immune cells like neutrophils, dendritic cells (DCs), and monocytes to respond to the intruder. They move across the endothelium and respond to local signals by releasing mediators or cytotoxic compounds, phagocytosing, or polarizing. To study local pathogen-induced inflammation, a zymosan-induced inflammation model was used in the hind paws of mice, which caused a Toll-like receptor 2 mediated inflammation. Multi-Epitope-Ligand-Cartography (MELC) was used for multiple sequential immunohistochemistry with 40 different antibodies on the same tissue. Bioinformatic analysis and graphical representation revealed a specific inflammatory architecture consisting of three major areas based on macrophage polarization and their cellular neighborhoods: a core region containing the pathogen, a pro-inflammatory region containing M1-like macrophages, and a region containing anti-inflammatory cells. This discovery highlights the coexistence of pro- and antiinflammatory processes during an ongoing inflammation and challenges the concept of a gradual temporal transition from pro- to anti-inflammation. Flow cytometry of the whole paw was performed to support and refine the MELC results. Eosinophils were used as a specific immune cell population to investigate their role in the inflammatory structure. They were found to be present in all three inflammatory regions, adapting their cytokine profile according to their localization. Depleting eosinophils reduced Interleukin 4 (IL-4)- levels, increased edema formation, and mechanical and thermal hypersensitivities during inflammation resolution. In the absence of eosinophils, pro- and anti-inflammatory region could not be determined in the inflammatory architecture, neutrophil numbers increased, and efferocytosis and M2-macrophage polarization were reduced. IL-4 administration restored these regions, normalized neutrophil numbers, efferocytosis, M2-macrophage polarization, and resolution of zymosan-induced hypersensitivity. The results show that eosinophils expressing IL-4 support the resolution of inflammation by enabling the development of an anti-inflammatory framework that encloses pro-inflammatory regions.
In Deutschland leidet ca. jeder zehnte Mensch über 40 Jahren an einer chronischen Einschränkung seiner Nierenfunktion. Nicht wenige davon sind im Laufe der Erkrankung auf eine Nierenersatztherapie angewiesen. Die Ursachen für eine Nierenschädigung sind vielfältig. Als neuartiger und vielversprechender Therapieansatz werden aktuell Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) als Therapeutikum für diverse Nierenerkrankungen getestet. Erste Ergebnisse klinischer Phase-I-Studien zeigen, dass MSC sicher als Immunsuppressivum nach Nierentransplantation angewendet werden können. Auch für weitere Erkrankungen der Niere sind erste klinische Studien am Laufen. MSC gelten als regenerativ, immunsupprimierend und antientzündlich. Dennoch gibt es noch einige Limitationen. Nach der Transplantation der Zellen ist das Wachstum der Zellen oft eingeschränkt und es kommt zur vermehrten Apoptose. Auch wird immer wieder ein paradoxes und entzündungsförderndes Verhalten der MSC am Wirkort beobachtet. Ein wichtiger Lösungsansatz ist eine in vitro Vorbehandlung der MSC zur Modulierung der zellulären Eigenschaften. In dieser Arbeit wurden drei Substanzen und Arzneimittel auf ihre Fähigkeit untersucht, die entzündungshemmenden Eigenschaften der MSC zu verbessern und die entzündungsfördernden zu unterdrücken. Der Fokus lag hierbei auf dem Arzneimittel Niclosamid und den beiden bisher noch nicht zugelassenen Substanzen Berberin und Gedunin, die alle in vitro und in vivo bereits erste vielversprechende antientzündliche Wirkungen bewiesen haben. Für diese Arbeit wurden MSC aus Fettgewebe isoliert (ASC) und mit LPS oder einem Cytokin-Mix (Mischung aus TNF-α, IFN-γ und IL-1β) sowie den drei Substanzen stimuliert. Untersucht wurden im Anschluss die mRNA-Expressionen der gängigsten proinflammatorischen (TNF-α, IL-6, TLR-4, ICAM-1, HLA-DR) und antiinflammatorischen Marker (IDO, IL-10), sowie mittels ELISA die Protein-Freisetzung von IL-6 und IL-8. Die vielversprechendsten Ergebnisse ließen sich durch Berberin hervorrufen. Hier zeigte sich eine deutliche Senkung der IL-8-Konzentration im ELISA. Die Anwendung des Gedunin hatte keine signifikante Wirkung auf die ASC. Niclosamid hingegen scheint widererwarten sogar entzündungsfördernd zu wirken, in dem es die IL-6-, ICAM-1-mRNA-Expression steigerte und die IDO-mRNA-Expression absenkte. Unter den drei getesteten Subtanzen hat Berberin die beste Wirkung bewiesen. Nach weiterer Testung könnte eine Anwendung mit Berberin als in vitro Präkonditionierung von MSC vielversprechend sein. Die Verwendung von Niclosamid hingegen sollte vermieden werden, die Wirkung von Gedunin müsste genauer untersucht werden.
Das Schilddrüsenkarzinom (SK) ist die häufigste bösartige endokrine Tumorerkrankung. Während das nicht-metastasierte und nicht-mutierte papilläre Schilddrüsenkarzinom (PSK) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FSK) eine gute Heilungschance aufweisen, zeigen die mutierten und metastasierten Varianten des PSK und FSK sowie das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ASK) weiterhin eine schlechte Prognose. Die Entwicklung von Therapieresistenzen stellen hierbei ein Hauptproblem in der Behandlung des fortgeschrittenen Schilddrüsenkarzinoms dar.
In den letzten Jahren wurden in Studien zunehmend Tumor-initiierende Zellen (TIZ) beschrieben, welche eine kleine Subpopulation von Zellen mit der Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Tumorinitiierung und Entwicklung von Therapieresistenzen von Tumoren darstellen. Die Existenz von TIZ wurde auch im SK nachgewiesen. Ein entscheidender Faktor für die Persistenz von TIZ ist die Hypoxie, welche über eine Veränderung des Tumormikromilieus und des Zellmetabolismus zur Entstehung von Therapieresistenzen beiträgt. Ein durch Hypoxie hochreguliertes Enzym ist die Carboanhydrase IX (CAIX). CAIX wird hauptsächlich von Tumorzellen exprimiert und katalysiert die Reaktion von Kohlendioxid zu Bicarbonat und einem Proton und trägt damit zur Säurepufferung der Tumorzelle bei. CAIX stellt somit einen entscheidenden Faktor für das Überleben von Tumorzellen in einem hypoxischen Milieu dar. Des Weiteren ist eine erhöhte Expression von CAIX mit einem schlechten Patienten-Outcome assoziiert, wie z.B. im Brustkrebs. Diese Eigenschaften machen CAIX zu einem attraktiven Angriffspunkt einer zielgerichteten Tumortherapie. Die vorliegende Studie hat zum Ziel, die Expression von CAIX sowie dessen biologische Rolle im Schilddrüsenkarzinom näher zu untersuchen.
Hierzu wurden Proben von 114 SK-Patienten immunhistochemisch auf eine CAIX-Expression untersucht und mit tumorfreiem Schilddrüsengewebe verglichen. Hierbei waren unterschiedliche SK-Subtypen vertreten. Für eine weitere Validierung der Expressionsdaten erfolgte die Auswertung eines Datasets von „The Cancer Genome Atlas“ (TCGA) mithilfe von cBioportal. Da die Hypoxie ein wichtiger Faktor für die Persistenz von TIZ ist, wurde die CAIX-Expression in Tumorsphären, ein in vitro Nachweis von TIZ-Aktivität, mittels der Durchflusszytometrie bestimmt und mit der CAIX-Expression von Monolayern verglichen. Als SK-Zelllinien wurden BCPAP (PSK), FTC 133 (FSK) und 8505 C (ASK) verwendet. Anschließend wurde mithilfe der Polymerasekettenreaktion und Immunofluoreszenzfärbung untersucht, ob eine CAIX-Expression in den Tumorsphären mit der Expression von bereits bekannten Stammzellmarkern, u.a. NANOG, assoziiert ist. Die Unterschiede der CAIX-Expression, nach Inkubation der Monolayer jeweils in Normoxie und Hypoxie, wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Mithilfe eines genetischen CAIX-Knockdowns sowie einer pharmakologischen Inhibition mit dem CAIX-Inhibitor Methazolamid (MZM) wurde die Tumorzellproliferation und -Sphärenbildung unter Normoxie und Hypoxie bestimmt. Zusätzlich wurde der Einfluss von MZM auf die Apoptose und den Zellzyklus untersucht.
Immunhistochemische Färbungen der Gewebeproben von SK-Patienten zeigten, dass die CAIX-Expression sowohl im PSK und FSK als auch im ASK im Vergleich zum tumorfreien Schilddrüsengewebe erhöht war. Des Weiteren zeigte die klinisch-pathologische Datenanalyse, dass eine erhöhte CAIX-Expression mit dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen im differenzierten SK assoziiert war. Auch die Analyse des TCGA-Datasets bestätigte, dass eine erhöhte Expression der CAIX-mRNA mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, Fernmetastasen und mit einem kürzeren Gesamt-Überleben von SK-Patienten korrelierte. Die weiteren funktionellen in vitro Untersuchungen ergaben, dass die CAIX-Expression in den Tumorsphären im Vergleich zu Monolayern erhöht und mit einer erhöhten Expression von Stammzellmarkern assoziiert war. Ein genetischer CAIX-Knockdown und eine CAIX-Inhibition mit MZM führten über eine Induktion der Apoptose und eines Zellzyklusarrests zu einer verminderten Tumorzellproliferation und Sphärenbildung.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass CAIX ein vielversprechendes Zielmolekül für eine gezielte Tumortherapie des fortgeschrittenen SK ist. Um diese Hypothese bestätigen zu können, sind jedoch weitere prospektive Analysen von Patientenproben sowie funktionelle in vivo Untersuchungen am SK nötig.
Einleitung: Die Zentrale Notaufnahme (ZNA) stellt eine Schnittstelle zwischen prä- und innerklinischer Versorgung dar. Das Spektrum der Krankheitsbilder erstreckt sich über jegliche Fachrichtungen und variiert von harmlosen Banalitäten bis zu akuten Notfällen. Eine sichere und suffiziente Primärversorgung ist die Basis eines qualitativ-hochwertigen Gesundheitssystems.2 Verspätete oder falsche Diagnosen in der ZNA sind mit 10-30 % keine Seltenheit.
Dies ist nicht nur für den individuellen Patienten belastend, es bedeutet auch einen zusätzlichen Ressourcenverbrauch und eine finanzielle Belastung für das Gesundheitssystem. Clinical Decision Support Systems (CDSS) haben das Potenzial, sowohl professionelle Anwender als auch Laien bei ihrer Diagnosefindung zu unterstützen. Fragestellung: Ziel der Arbeit ist es herauszufinden, welchen Einfluss der Diagnosezeitpunkt auf das Outcome von Patienten mit Abdominalschmerzen in der ZNA hat und inwiefern ein CDSS das Potenzial hat, die genannten Punkte zu beeinflussen.
Methoden: Es handelte sich um eine prospektive, doppelt verblindete Beobachtungsstudie. Patienten, die sich mit Abdominalschmerzen in der Notaufnahme vorstellten, gaben ihre Symptome in die Ada-App ein. Sowohl die Diagnosevorschläge der App als auch die Verdachtsdiagnosen des behandelnden Arztes wurden dokumentiert und verglichen. Weitere erhobene Parameter waren die Verwendung von apparativer Diagnostik, die vergangene Zeit bis zur endgültigen Diagnosestellung, das Auftreten von Komplikationen, die Komorbidität und Mortalität sowie die Länge des Krankenhausaufenthalts. Das Follow-Up erfolgte zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu Tag 90. Für die Analyse wurden die 450 Patienten anhand des Zeitpunkts ihrer Diagnosestellung in Gruppen "früh" (Tag 0) und "spät" (Tag 1-24) eingeteilt.
Ergebnisse: Im Vergleich zur „frühen“ Gruppe, hatte die Gruppe der „spät“ diagnostizierten Patienten einen höheren Anteil von Männern (45.2% (n=168/372) versus 60.3 % (n=47/78); p=0.018), im Schnitt einen höheren Charlson Comorbidity Index (0.7 versus 1.1; p=0.045) und im Schnitt einen höheren RAI-C Score (8.06 versus 9.9; p<0.001) am Tag ihrer Vorstellung. Bei den „spät“ diagnostizierten blieben weniger Patienten komplikationsfrei (57.0 % 49 (n=212/372) versus 17.9% (n=14/78); p<0.001), es traten mehr Major-Komplikationen auf (8.9% (n=33/372) versus 17.9% (n=14/78); p=0.024), analog dazu war der Comprehensive Complication Index höher (13.1 versus 25.6; p<0.001) und sie verweilten länger im Krankenhaus (2.6 Tage versus 6.7 Tage; p<0.001). Zudem nahmen sie signifikant mehr apparative Diagnostik in Anspruch.
Die behandelnden Ärzte konnten in 82.6% der Fälle (n=372/450) am Tag der Vorstellung die korrekte Diagnose stellen. Die Ada-App konnte in insgesamt 52% der Fälle (n=234/450) die korrekte Diagnose unter ihren Diagnoseverschlägen nennen.
Schlussfolgerung: Multimorbide Patienten scheinen anfälliger zu sein für falsche und verspätete Diagnosen. Ein später Diagnosezeitpunkt korreliert mit der vermehrten Nutzung apparativer Diagnostik, einem komplikationsreicheren Verlauf, einer höheren Komorbidität und einem längeren Krankenhausaufenthalt.
Die Ada-App ist den Ärzten zwar unterlegen, dennoch ist Potenzial vorhanden.
Für Ärzte kann die Ada-App eine Unterstützung im Rahmen der Diagnosefindung darstellen. Neben der Ressourcenentlastung kann sie vor Fehlannahmen und frühzeitigen Schlussfolgerungen schützen und auf weitere mögliche Differentialdiagnosen hinweisen. Die Ada-App stellt für Laien mit Sicherheit eine Weiterentwicklung gegenüber der simplen Symptomsuche über das Internet dar, dennoch sollten weitere Studien den Nutzen und die Sicherheit der App überprüfen.
Finanzielle Armut prägt Mobilitätspraktiken und kann dabei zum Prozess von mobilitätsbezogener sozialer Exklusion beitragen. Zu den Personen, deren Armutsrisiko besonders hoch ist, zählen in Deutschland Haushalte mit Kindern, insbesondere Alleinerziehende. Ältere Menschen haben nicht die höchste Armutsgefährdung, jedoch besteht bei ihnen das Risiko von Verharrung in Armut, da die Möglichkeiten, die finanzielle Situation aus eigener Kraft zu ändern mit zunehmendem Alter sinken.
Um ein tieferes Verständnis davon zu erhalten, wie finanzielle Armut die Mobilitätspraktiken und soziale Teilhabe von Haushalten mit Kindern sowie älteren Menschen prägt, wurden mit diesen beiden Personengruppen problemzentrierte Interviews in Ronnenberg (Region Hannover) geführt und analysiert. Die Ergebnisse belegen, dass, wenngleich alle Befragten mit ähnlich geringen finanziellen Ressourcen haushalten und Verzicht sowie Abwägungsprozesse notwendig sind, sich ihre Mobilitätspraktiken und Alltagsbewältigungsstrategien unterscheiden, was sich in zwei Typologien widerspiegelt. Erstens, eine Typologie der Mobilitätspraktiken von Haushalten mit Kindern: (i) autozentriert, (ii) autoreduziert, (iii) ÖPNV-orientiert und (iv) nichtmotorisiert. Zweitens, eine Typologie älterer Menschen anhand ihrer Mobilitätspraktiken: (i) aktive ältere Menschen mit vielseitigen sozialen Interaktionen, (ii) nachbarschaftsorientierte ältere Menschen mit lokalen Kontakten und (iii) ältere Menschen, die überwiegend zu Hause sind und wenig soziale Kontakte haben.
Um herauszufinden, inwiefern mobilitätsbezogene Barrieren der sozialen Teilhabe reduziert werden können, wurden fünf Maßnahmen bezüglich ihrer Wirkung auf die Mobilitätspraktiken einkommensarmer Haushalte mit Kindern untersucht: einerseits die Wirkung des 9-Euro-Tickets anhand von problemzentrierten Interviews mit einkommensarmen Haushalten mit Kindern, andererseits anhand von Expert:inneninterviews die Wirkung von Radlernkursen für Frauen mit Migrationshintergrund, eines Mietertickets, eines Quartierstickets und der Verbesserung der Nahraum- und Aufenthaltsqualität am Beispiel von Tempo 30. Die Ergebnisse zum 9-Euro-Ticket belegen, dass ein erschwingliches ÖPNV-Ticket erheblich zur Reduzierung mobilitätsbezogener Barrieren der sozialen Teilhabe im Armutskontext beiträgt. Die Expert:inneninterviews zeigen auf, dass eine Förderung des Umweltverbunds zielführend ist, um zu einer sozial-ökologischen Verkehrswende beizutragen und insbesondere Maßnahmenbündel Wirkung auf die Reduzierung von mobilitätsbezogenen Barrieren der sozialen Teilhabe entfalten.
Die Erkenntnisse dieser Dissertation ergänzen den wissenschaftlichen Forschungstand um ein tiefergehendes Verständnis der Wirkung von finanzieller Armut auf die Mobilitätspraktiken und soziale Teilhabe von Haushalten mit Kindern und älteren Menschen und helfen dabei, Maßnahmen zur Reduzierung mobilitätsbezogener Barrieren der sozialen Teilhabe zu konzipieren und umzusetzen.
This thesis is concerned with the investigation of static and dynamic properties of quantum Heisenberg paramagnets in the absence of a magnetic field and therefore for vanishing magnetization. For this purpose a new formulation of the spin functional renormalization group (SFRG) is employed. The first manifestations of the SFRG were developed by Krieg and Kopietz, motivated by the FRG approach to ordinary field theories and the older works of Vaks, Larkin and Pikin on diagrammatic methods for spin operators.
The main idea is to study quantum spin systems by considering the evolution of correlation functions under a continuous deformation of the interaction between magnetic moments, starting from a solvable limit. This leads to nonperturbative results for quantities like the spin-spin correlation function. After a basic introduction to the phenomena and concomitant problems discussed in this thesis, a detailed description of the SFRG method in its initial formulation is given in the second chapter. We start with the generating functional of connected imaginary-time spin-correlation functions GΛ [h], for which an exact flow equation is derived. A particular issue, already pointed out by Krieg and Kopietz, arises here, namely the singular non-interacting limit of its subtracted Legendre transform ΓΛ [m]. As a consequence the initial condition of that functional does not have a proper series expansion in powers of m. This prevents us from working directly within a pure one-particle irreducible (1-PI) parametrization of the correlation functions, as is often done in the context of field theories. Thus motivated, we develop a workaround explicitly tailored to paramagnets, which provides us with a functional that has a well-behaved Legendre transform. The new approach is based on a different treatment of fluctuations at zero and finite frequencies, analogous to a previous hybrid formulation for the symmetry-broken phase. Certain properties, considered to be highly relevant for isotropic paramagnets, as well as previous observations, already made in the study of simpler spin systems like the Ising model, serve as additional justifications for choosing this construction.
In the third chapter our new method is assessed by calculating the dynamic susceptibility G(k, iω) and thus the dynamic structure factor S(k, ω) in the symmetric phase. For this purpose an approximate integral equation for the dynamic polarization function Π̃(k, iω) was derived. This equation results from a truncation of the hierarchy of flow equations and contains static quantities, that are assumed to be known from another source. Our first application is the high-temperature limit T → ∞ in d ≤ 3 dimensions. Salient features, believed to be part of the spin dynamics in isotropic Heisenberg magnets are also exhibited by our solution, like (anomalous) diffusion in a suitable hydrodynamic limit. Moreover we obtain the same order of magnitude for the diffusion coefficient D as in experiments and other theoretical calculations. Other aspects do not entirely agree with previous approaches.
Afterwards we continue by investigating systems close to the critical point Tc. Dynamic scaling forms for Π̃(k, iω) and S(k, ω), which, like spin diffusion, are postulated on the basis of quite general physical arguments, are reproduced. Agreement of the line-shapes 2with neutron scattering experiments at T = Tc is found to be satisfying, with deviations for ω → 0, that may be attributed to the simplicity of the approximation, like at infinite temperature.
Finally, we focus our attention on the thermodynamic properties of isotropic Heisenberg paramagnets by calculating the static susceptibility G(k). For this purpose we employ simple truncation schemes of the flow equations for the static self-energy ΣΛ (k) and four-spin vertex ΓΛ , together with a basic ansatz for the dynamic polarization Π̃(k, iω) in quantum systems. As a result we obtain transition temperatures Tc of three-dimensional nonfrustrated magnets within an accuracy of 5 percent compared to established benchmark values from Quantum Monte Carlo and high temperature expansion series. We conclude this chapter by giving an outlook on the application of our method to frustrated systems, which may require a combined non-trivial calculation of static and dynamic properties.
This work aimed to investigate the regulation and activity of 5-lipoxygenase (5-LO), the central enzyme in leukotriene biosynthesis, in two colorectal cancer cell lines. The leukotriene pathway is positively correlated with the progression of several solid malignancies; however, factors regulating 5-LO expression and activity in tumors are poorly understood.
Cancer development, as well as cancer progression, are strongly dependent on the tumor microenvironment. In the conventional monolayer culture of cancer cell lines, cell-matrix and cell-cell interactions present in native tumors are absent. Furthermore, it is already known that various colon cancer cell lines dysregulate several important signaling pathways due to 3D growth. Therefore, the expression of the leukotriene cascade in HT-29 and HCT-116 colorectal cancer cells was investigated within a three-dimensional context using multicellular tumor spheroids to mimic a more physiological environment compared to conventional cell culture. Especially the expression of 5-LO, cPLA2α, and LTA4 hydrolase was altered due to threedimensional (3D) cell growth, which was investigated by qPCR and Western blot analysis. High cellular density in monolayer cultures led to similar results. The observed 5-LO upregulation was found inversely correlated with cell proliferation, determined by cell cycle analysis, and activation of PI3K/mTORC-2- and MEK-1/ERK-dependent pathways, determined using pharmacological pathway inhibition, stable shRNA knockdown cell lines, and analysis via qPCR and Western blot analysis. Following, the transcription factor E2F1 and its target gene MYBL2 were identified to play a role in the repression of 5-LO during cell proliferation. For this purpose, several stable MYBL2 over-expression and ALOX5 reporter cell lines were prepared and analyzed. Since 5-LO was already identified as a direct p53 target gene, the influence of p53, which is variably expressed in the cell lines (HT-29, p53 R273H mut; HCT-116 p53 wt; HCT-116 p53 KO), was investigated as well. Furthermore, HCT-116 cells carrying a p53 knockout were investigated. The PI3K/mTORC-2- and MEK-1/ERK-dependent suppression of 5-LO was also found in tumor cells from other origins (Capan-2, Caco-2, MCF-7), which was determined using pharmacological pathway inhibition and following analysis via qPCR. This suggests that the identified mechanism might apply to other tumor entities as well.
5-LO activity was previously described as attenuated in HT-29 and HCT-116 cells compared to polymorphonuclear leukocytes, which express a highly active 5-LO. However, the present study showed that the enzyme activity is indeed low but inducible in HT-29 and HCT-116 cells. Of note, the general lipid mediator profile and the mediator concentrations were comparable to those of M2 macrophages. Finally, the analysis of substrate availability in HT-29 and HCT-116 cells revealed a vast difference between formed metabolite concentrations and supplemented fatty acid concentrations, indicating that the substrates are either transformed into lipoxygenase-independent metabolites or are esterified into the cellular membrane.
In summary, the data presented in this work demonstrate that 5-LO expression and activity are tightly regulated in HT-29 and HCT-116 cells and fine-tuned due to environmental conditions. The cells suppress 5-LO during proliferation but upregulate the expression and activity of the enzyme under cellular stress-triggering conditions. This implies a possible role of 5-LO in manipulating the tumor stroma to support a tumor-promoting microenvironment.
Weltweit gibt es laut WHO ca. 58 Millionen Menschen mit einer chronischen Hepatitis-C-Virus (HCV) Infektion und jährlich stecken sich ca. 1,5 Millionen Menschen neu mit diesem Virus an (Stand 2019). Da die Folge einer chronischen Hepatitis-C-Virus Infektion eine potenziell tödlich verlaufende Leberzirrhose oder die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms sein können, ist eine frühe Diagnose und eine adäquate Therapie eine wichtige Aufgabe in der Medizin.
Die bisherige Therapie erfolgte mittels pegyliertem Interferon und Ribavirin und seit einigen Jahren auch interferonfrei mittels Direkter Antiviraler Agenzien (DAA). Vor allem beim älteren Therapieregime konnten viele Nebenwirkungen und häufiger auch ein Therapieversagen auftreten, sodass ein leicht zu gewinnender Biomarker nützlich wäre, der die Patienten mit Therapieversagen frühzeitig und im besten Fall sogar vor Therapiebeginn detektieren kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Spiegel von extrazellulär im Blut zirkulierender, leberspezifischer microRNA miR-122 auf Eigenschaften als solche potenzielle Biomarker untersucht. Dazu wurden die Patientenseren von insgesamt 60 Patienten mit chronischer Hepatitis-C-Virus Infektion analysiert, die mittels pegyliertem Interferon und Ribavirin behandelt wurden. Vor, während und nach der Therapie wurden verschiedene Laborparameter sowie die miR 122 in den Patientenseren bestimmt. 20 dieser Patienten zeigten ein dauerhaftes Ansprechen auf die Therapie (sustained virological response = SVR), 20 zeigten nach einem initialen Therapieansprechen ein Rückfall der Erkrankung (Relapse) und 20 Patienten sprachen gar nicht auf die Therapie an (Non-Responder = NR).
Zunächst wurden die sogenannten Baseline-Charakteristika der Patienten vor Therapiebeginn untersucht. Dabei konnten wir jedoch keinen Unterschied zwischen den Patientengruppen hinsichtlich der Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST), zwei Laborparameter zur Bestimmung einer Leberschädigung, sowie der HCV-RNA, ein Parameter zur Bestimmung der Viruslast bei Patienten mit einer HCV-Infektion, feststellen.
Auch die miR-122-Spiegel zeigten vor Therapiebeginn keinen signifikanten Unterschied zwischen den drei Patientengruppen. Daraus wurde geschlossen, dass man die miR-122 vor Therapiebeginn nicht als prognostischen Marker für einen Therapieerfolg verwenden kann.
Beim Vergleich der miR-122-Spiegel mit den Laborparametern konnte eine signifikante Korrelation zwischen der miR-122 und der ALT, AST und der Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) festgestellt werden. Die miR-122 scheint somit ähnlich wie die anderen Laborparameter eine Leberzellschädigung widerzuspiegeln.
Nach dem Therapiebeginn konnte bereits ab Woche 4 ein signifikanter Unterschied zwischen den SVR und Non-Respondern sowie zwischen den Relapsepatienten und den Non-Respondern festgestellt werden. Jedoch war der Unterschied zwischen den SVR und den Relapse-Patienten nicht signifikant, sodass man weiterhin keine Unterscheidung dieser beiden Patientengruppen machen konnte.
Auch die ALT- und HCV-RNA-Spiegel zeigten einen ähnlichen Verlauf. In den Gruppen der SVR und Relapse-Patienten zeigte sich im Laufe der Therapie ein Rückgang der Parameter wohingegen die Gruppe der Non-Responder keine signifikante Dynamik aufwies.
Zum Schluss wurden die miR-122-Spiegel 12 bzw. 24 Wochen nach Therapieende bestimmt, dem sogenannten Zeitpunkt des Follow-Up bei dem der Therapieerfolg laut Leitlinie mit Hilfe der HCV-RNA-Messung bestimmt wird. Dabei konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den miR-122-Spiegeln bei den SVR-Patienten und den anderen beiden Patientengruppen festgestellt werden.
In Zusammenschau dieser Ergebnisse kann man sagen, dass die miR-122 gut geeignet ist um ähnlich wie die HCV-RNA den Therapieverlauf widerzuspiegeln. Als prognostischer Parameter bzw. Biomarker für ein Therapieansprechen ist sie jedoch nicht geeignet, da keine Unterscheidung zwischen den einzelnen Patientengruppen vor Therapiebeginn möglich ist und während der Therapie lediglich die Non-Responder und nicht die Relapse-Patienten detektiert werden können.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Fragestellung, inwieweit ORF10 von B. recurrentis, dem Erreger des Läuserückfallfiebers, mit verschiedenen Komplementkomponenten interagieren kann.
Mit funktionellen Komplementtests konnte gezeigt werden, dass ORF10 den klassischen, den alternativen sowie den Lektin-Weg inhibiert, wobei sich die stärkste Inhibition gegenüber dem alternativen Weg manifestierte. Darüber hinaus ließ sich in einem Zell-basierten Hämolyse-Assay eine Inhibition des terminalen Komplementweges durch ORF10 nachweisen.
Die durchgeführten Bindungsanalysen mit verschiedenen Komplementkomponenten führten zu dem Ergebnis, dass ORF10 mit C1q, C1s, C3, C3b, C4b und C5 interagiert und diese Protein-Protein-Interaktion mit den Komplementkomponenten C1q, C3, C3b und C4b durch einen dosisabhängigen Verlauf charakterisiert ist. Eine Bindung von C1r, C2, C4, FB, FH sowie FI konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Auf Basis der modellierten Struktur von ORF10 wurden mithilfe der In-vitro-Mutagenese drei verschiedene Varianten generiert, die jedoch nicht affinitätschromatographisch aus E. coli-Zelllysaten isoliert werden konnten und deshalb nicht für weiterführende funktionelle Analysen zur Verfügung standen.
Die Ergebnisse der Serumbakterizidie-Tests mit einem „gain of function“-Borrelienstamm, welcher ORF10 heterolog produzieren sollte, ergaben, dass keine erhöhte Resistenz gegenüber Humanserum nachgewiesen werden konnte. Inwieweit ORF10 bei der intrinsischen Serumresistenz von B. recurrentis beteiligt ist, lässt sich abschließend nicht vollumfänglich erklären.