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Lange ging man davon aus, dass die Physiologie der Thyroidhormone weitestgehend erforscht ist und nahm an, dass sämtliche Thyroidhormon-Wirkungen auf einer Bildung von L-Thyroxin (T4) und einer anschließenden Deiodierung zu Triiodthyronin (T3) beruhen, welches an die nukleären Thyroidhormon Rezeptoren (THRs) bindet. Über die THRs werden genomische Signalwege vermittelt, die während der Wachstums- und Entwicklungsphase essentiell sind. Beim Erwachsenen werden zudem vorwiegend katabole Stoffwechsel-Prozesse induziert. Jedoch zeigte sich in den letzten 20 Jahren, dass die Signalwege der Thyroidhormone komplexer sind als bisher angenommen. Vor allem die Metabolite des in der Schilddrüse gebildeten T4s, zeigen ein breites Interaktions-Profil mit anderen molekularen Zielstrukturen. Thyronamine, die decarboxylierten Thyroidhormon-Metabolite, binden beispielsweise den G-Protein-gekoppelten Trace Amine Associated Receptor 1 (TAAR1). Wird dieser Rezeptor aktiviert, kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einem rapiden Abfall der Köpertemperatur, sowie zu einer akuten Bradykardie. Die durch oxidative Deaminierung gebildeten Iodthyroacetate Tetraiodthyroacetat (TETRAC) und Triiodthyroacetat (TRIAC) sind Antagonisten des Membran-Rezeptors Integrin αVβ3 und besitzen antiproliferative und pro-apoptotische Eigenschaften.
In dieser Arbeit sollte die Hypothese untersucht werden, ob Thyroidhormone neben diesen neuen zumeist nicht-genomischen Signalwegen, auch THR-unabhängige genomische Wirkmechanismen besitzen.
Mit Hilfe eines Gal4-Luciferase-Reportergen-Assays wurde in einem Screening die Aktivität einiger Thyroidhormone und Thyroidhormon-Metabolite an elf THR-ähnlichen Rezeptoren und den drei Retinoid X Rezeptor (RXR)-Subtypen untersucht. Es konnte detektiert werden, dass Thyroidhormone, vor allem TETRAC, potente Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)γ-Agonisten sind, die zum Teil zusätzlich dessen Heterodimer-Partner RXR aktivieren können. Diese PPARγ- und RXR-Aktivität wurde zunächst mit Hilfe eines Coaktivator-Rekrutierungs-Assays, einer Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und einer Kristallstrukturanalyse genauer charakterisiert. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass sowohl PPARγ, als auch RXR in artifizielleren Testsystemen durch Thyroidhormone aktiviert werden. Zum anderen konnte die für permissive Heterodimere, wie das PPARγ/RXR-Heterodimer, typische additive Transaktivierungs-Effizienz nach Bindung beider Heterodimer-Partner bestätigt werden. Außerdem zeigte die Untersuchung der Kristallstruktur von TETRAC und PPARγ, dass Thyroidhormone einen abweichenden Bindungsmodus im Vergleich zu anderen PPARγ Agonisten, wie den Glitazonen und entsprechende Fettsäuren oder Fettsäuremimetika, besitzen.
Die Evaluation der biologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Heterodimer-Aktivierung ergab zudem, dass TETRAC, als potentester PPARγ-Agonist, in der Lage ist die Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten zu induzieren. Außerdem wurde die mRNA-Expression wichtiger PPARγ-regulierter Gene in Hepatozyten trotz knockdown beider THR-Isoformen signifikant durch Thyroidhormone induziert.
Für eine erste Abschätzung einer möglichen physiologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Aktivierung durch Thyroidhormone, wurde die Bildung von TETRAC nach Inkubation von Hepatozyten mit T4 quantifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass ausreichend TETRAC in den Hepatozyten gebildet werden kann, um PPARγ zu aktivieren. Auch in einem in vivo-Experiment, bei dem Mäusen ein mit Brom substituiertes T4-Analog (Br-T4) appliziert wurde, um Interferenzen mit der endogenen Thyroidhormon-Produktion zu verhindern, konnte gezeigt werden, dass die PPARγ-regulierte Genexpression in den Lebern der Tiere induziert wurde. Dies deutete auf eine physiologisch relevante Bildung von Br-TETRAC hin, da Br-TETRAC analog zu TETRAC eine hohe Bindungs-Aktivität an PPARγ besaß, während Br-T4 keine Aktivität an diesem Rezeptor aufwies.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Thyroidhormone neben den THR-vermittelten Effekten auch andere genomische Wirkmechanismen besitzen, indem sie das PPARγ/RXR-Heterodimer aktivieren. Diese biologische Aktivität könnte sowohl eine physiologische als auch eine pharmakologische Relevanz besitzen. Die beiden T4-Metabolite T3 und TETRAC sind in der Lage komplementäre Signalwege zu induzieren. Wird T4 deiodiert kommt es zur Bildung von T3, welches den THR aktiviert. Durch oxidative Deaminierung des T4s bildet sich TETRAC, das wiederum PPARγ bindet und aktiviert. Durch die vermehrte Bildung von TETRAC und anschließende Aktivierung von PPARγ könnte die katabole Wirkung der THR-Signalwege abgeschwächt werden und so eine Art negative Rückkopplung gewährleistet werden. Die physiologische Bedeutung der Interaktion von Thyroidhormonen mit PPARγ/RXR muss jedoch noch genauer untersucht werden.
Aber auch pharmakologisch könnte die Iodthyroacetat-Aktivität an PPARγ eine Rolle spielen. TETRAC könnte durch seinen individuellen Bindungsmodus als Leitstruktur für neue PPARγ-Partialagonisten mit verbessertem Nebenwirkungs-Profil dienen. Außerdem wird das Thyroidhormon-Derivat TRIAC schon jetzt als Leitstruktur für die Entwicklung von Thyroidhormon-Analoga mit THRβ-Selektivität verwendet. Durch die zusätzliche PPARγ-Aktivität könnte zukünftig ein dualer THRβ/PPARγ-Agonist bei Erkrankungen, die mit einer Insulinresistenz einhergehen, Verwendung finden.
Zusammenfassend stellt die Entdeckung der Aktivität von Thyroidhormonen an PPARγ und RXR einen weiteren Baustein im komplexen System der Thyroidhormone dar.
Polyketides are highly valuable natural products, which are widely used as pharmaceuticals due to their beneficial characteristics, comprising antibacterial, antifungal, immunosuppressive, and antitumor properties, among others. Their biosynthesis is performed by large and complex multiproteins, the polyketide synthases (PKSs). This study solely focuses on the class of type I PKSs, which arrange all their enzymatic domains on one or more polypeptides. Despite their high medical value, little is known about mechanistic details in PKSs.
One central domain is the acyl transferase (AT), which is present in all PKSs and channels small acyl substrates into the enzyme. More precisely, the AT loads the substrates onto the essential acyl carrier protein (ACP), which subsequently shuttles the substrates and all intermediates for condensation and modification to additional domains to build the final polyketide.
Some PKSs use their domains several times during biosynthesis and work iteratively – these are called iterative PKSs. Others feature several sets of domains, each being used only once during biosynthesis – these PKSs are called modular PKSs. All PKSs or PKS modules consist of minimum three essential domains to connect the acyl substrates. Three modifying domains are optional and can enlarge the minimal set. According to the domain composition, the acyl substrate is fully reduced, partly reduced, or not reduced at all. This variation of modifying domains accounts for the huge structural and therefore functional variety of polyketides.
Even though the structure of fatty acids is not exactly reminiscent of polyketides, their biosynthetic pathways are closely related. Fatty acid biosynthesis is carried out by fatty acid synthases (FASs), which share many similarities with PKSs. Both megasynthases feature the same domains, performing the same reactions to connect and modify small acyl substrates. In contrast to PKSs, FASs always contain one full set of modifying domains which is used iteratively, leading to fully reduced fatty acids.
The present thesis extensively analyzes the AT of different PKSs in its substrate selectivity, AT-ACP domain-domain interaction, and enzymatic kinetic properties. The following key findings are revealed through comparison: 1.) ATs of PKSs appear slower than the ones of FASs, which may reflect the different scopes of biosynthetic pathways. Fatty acids as essential compounds in all organisms are needed in high amounts for physiological functions, whereas polyketides as secondary metabolites only require basal concentrations to take effect. 2.) The slower ATs from modular PKSs do not load non-native substrates even in absence of the native substrates. This is different to the faster ATs from iterative PKSs and FASs, which indicates high substrate specificity solely for the ATs from modular PKSs and emphasizes their role as gatekeepers in polyketide synthesis. 3.) The substrate selectivity can emerge in either the first or the second step of the AT-mediated ACP loading and is not assured by a hydrolytic proofreading function.
Moreover, a mutational study on the AT-ACP interaction in the modular PKS 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) shows that single surface point mutations can influence AT-mediated reactions in a complex manner. Data reveals high enzyme kinetic plasticity of the AT-ACP interaction, which was also recently demonstrated for the interaction in a type II FAS.
Based on these findings, the mammalian FAS is engineered towards a modular PKS-like as- sembly line with the long-term goal to rationally synthesize new products. Basically, three important aspects need to be considered: 1.) AT’s loading needs to be splitted in specific loading of a priming substrate by a priming AT and in specific loading of an elongation substrate by an elongation AT. 2.) FAS-based elongation modules need to be designed with varying domain compositions for introducing functional groups in the product. 3.) Covalent and non-covalent linkers need to be designed for connection of priming and elongation modules.
This study focuses on the first aspect, splitting loading of priming and elongation substrates. An elongation substrate-specific AT is installed in the mammalian FAS via domain swapping. Since ATs from modular PKSs were proven to be substrate specific, these are used to exchange the mammalian FAS AT. This work demonstrates that it is extremely challenging to create stable and functional chimeras, but first essential steps are taken. Proper domain boundaries for AT swapping are established and a stable chimera with 70 % wild type AT activity is created. However, this chimera is only of limited value for application in an elongation module due to the intrinsic slow turnover rate of the wild type AT. Using another PKS AT, a stable elongation module is designed and analyzed in its activity in combination with a priming module. These experiments demonstrate that the loading of priming substrates are successfully suppressed in the elongation module, but nonetheless only minor turnover rates are detected in the assembly line.
...
Background. Recent pathomolecular studies on the MLL-AF4 fusion protein revealed that the murinized version of MLL-AF4, the MLL-Af4 fusion protein, was able to induce leukemia when expressed in murine or human hematopoietic stem/progenitor cells (Lin et al. in Cancer Cell 30:737–749, 2016). In parallel, a group from Japan demonstrated that the pSer domain of the AF4 protein, as well as the pSer domain of the MLL-AF4 fusion is able to bind the Pol I transcription factor complex SL1 (Okuda et al. in Nat Commun 6:8869, 2015). Here, we investigated the human MLL-AF4 and a pSer-murinized version thereof for their functional properties in mammalian cells. Gene expression profiling studies were complemented by intracellular localization studies and functional experiments concerning their biological activities in the nucleolus.
Results: Based on our results, we have to conclude that MLL-AF4 is predominantly localizing inside the nucleolus, thereby interfering with Pol I transcription and ribosome biogenesis. The murinized pSer-variant is localizing more to the nucleus, which may suggest a different biological behavior. Of note, AF4-MLL seems to cooperate at the molecular level with MLL-AF4 to steer target gene transcription, but not with the pSer-murinized version of it.
Conclusion: This study provides new insights and a molecular explanation for the described differences between hMLL-hAF4 (not leukemogenic) and hMLL-mAf4 (leukemogenic). While the human pSer domain is able to efficiently recruit the SL1 transcription factor complex, the murine counterpart seems to be not. This has several consequences for our understanding of t(4;11) leukemia which is the most frequent leukemia in infants, childhood and adults suffering from MLL-r acute leukemia.
Mixed-valence compounds as polarizing agents for overhauser dynamic nuclear polarization in solids
(2021)
Herein, we investigate a novel set of polarizing agents—mixed-valence compounds—by theoretical and experimental methods and demonstrate their performance in high-field dynamic nuclear polarization (DNP) NMR experiments in the solid state. Mixed-valence compounds constitute a group of molecules in which molecular mobility persists even in solids. Consequently, such polarizing agents can be used to perform Overhauser-DNP experiments in the solid state, with favorable conditions for dynamic nuclear polarization formation at ultra-high magnetic fields.
Komplexe biologische Phänotypen resultieren aus einem koordinierten Zusammenspiel von einer Vielzahl von Genen. Um zu verstehen, wie Krankheiten durch genetische Dysfunktionen
entstehen können, ist es unabdingbar die genetischen Interaktionsnetzwerke in menschlichen Zellen zu entschlüsseln. Eine Identifizierung von Kontext-abhängigen genetischen Interaktionen kann bedeutende Erkenntnisse über die Beziehung von Phänotyp und Genotyp liefern und erklären, wie synergistische Gen-Funktionen die Entstehung von komplexen Krankheiten bedingen.
Gepoolte, kombinatorische CRISPR (kurz für: clustered regularly interspaced short palindromic repeats) Screens stellen eine wirkungsvolle Methode zur simultanen Untersuchung potentieller Interaktionen von einer großen Anzahl von Genen dar. Mit sogenannten multiplex CRISPR
gRNA Bibliotheken werden im Rahmen großangelegter Screens vielzählige kombinatorische Gen-Knockouts in Zellen generiert. Diese multiplex CRISPR gRNA Bibliotheken können aus bis zu hunderttausenden Plasmiden bestehen, die jeweils für eine andere gRNA-Kombination kodieren und auf ein spezifisches Gen-Paar abzielen. Im Gegensatz zu CRISPR Screens für Einzel-Knockouts gehen multiplex CRISPR Screens zur Identifizierung von genetischen Interaktionen mit zusätzlichen Herausforderungen einher: Zum einen wächst der verbundene Arbeitsaufwand für die Konstruktion der multiplex CRISPR gRNA Bibliotheken proportional mit der Anzahl der gewünschten Ziel-Gene, welche die Diversität der Bibliothek bestimmt. In einer idealen gRNA-Bibliothek wären alle gRNA-Sequenzen gleich häufig vorhanden. Jedoch weisen
gRNA-Bibliotheken aufgrund von technischen Beschränkungen gRNA-Sequenzen mit höherer, beziehungsweise niedriger Abundanz auf. Konventionelle Methoden zur Herstellung von
gRNA-Bibliotheken basieren beispielsweise auf iterativen, gepoolten Klonierungsschritten mit PCR-amplifizierten Oligonucleotiden, welche zu einer Ungleichverteilung oder zum Verlust von gRNA-Sequenzen führen können. Daher bieten Methoden zur gRNA-Bibliotheken-Generierung Optimierungspotenzial. Da die Reproduzierbarkeit der Screen-Ergebnisse durch die sogenannte Screening Coverage sichergestellt werden muss, erfordert eine Erhöhung der
Bibliotheks-Diversität gleichzeitig auch eine Vergrößerung des Versuchsmaßstabs und ist mit umfangreichem Zellkultur-Arbeitsaufwand verbunden. Die Screening Coverage gibt die
durchschnittliche Abundanz der einzelnen gRNA-Sequenzen in der Zellpopulation während des Screens an. Aktuelle Richtlinien empfehlen eine Screening Coverage, die zwischen dem 200- bis 1000-fachen Wert der Bibliotheks-Diversität liegt, allerdings fehlen bisher genaue Angaben die auf die verwendete gRNA Bibliothek abgestimmt sind. Deshalb stellt die benötigte Screening Coverage bisher einen limitierenden Faktor dar, der die Anzahl der möglichen Ziel-Gene-Kombinationen in einem Screen beschränkt.
In der vorliegenden Arbeit stellen wir eine neue Methode zur Generierung von multiplex gRNA Bibliotheken mit hohen Diversitäten vor. Die Methode, genannt 3Cs (covalently-closed circular-synthesized) Multiplexing, umgeht iterative, gepoolte Klonierugsschritte mit Restriktionsenzymen und PCR-Amplifikation von gRNA-kodierenden Oligonucleotiden. Wir
zeigen, dass 3Cs Multiplexing auf robuste Weise zur Herstellung von gleichmäßig verteilten multiplex gRNA Bibliotheken verwendet werden kann. Der Verteilungs-Skew, auch Skew-Ratio oder Bibliotheksbreite genannt, ist ein Maß zur Ermittlung der Gleichverteilung der gRNA-Sequenzen in der Bibliothek. Wir zeigen, dass 3Cs multiplex Bibliotheken typischerweise einen Verteilungs-Skew von 2.5 aufweisen, was unter den üblichen Werten von Einzel-gRNA Bibliotheken liegt.
Wir nahmen an, dass die gRNA-Bibliotheksverteilung die Robustheit von gepoolten CRISPR Screens beeinflussen könne und deshalb bei der Auswahl einer geeigneten Screening
Coverage berücksichtigt werden müsse. Um den Einfluss der gRNA-Bibliotheksverteilung auf die Screen-Qualität in Abhängigkeit von der verwendeten Screening Coverage zu untersuchen, generierten wir zwei künstlich fehlverteilte multiplex gRNA-Bibliotheken. Diese wurden, zusätzlich zu einer nahezu gleichverteilten multiplex gRNA-Bibliothek, jeweils mit einer 20- und 200-fachen Screening Coverage in einem kombinatorischen Proliferationsscreen angewandt.
Dadurch konnten wir die gRNA-Bibliotheksverteilung als den bestimmenden Parameter für die benötigte Screening Coverage identifizieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass 3Cs multiplex gRNA-Bibliotheken auf Grund ihrer gleichmäßigen Verteilung mit minimierter Screening Coverage eingesetzt werden können, was zu einer 10-fachen Reduktion des assoziierten Arbeitsaufwands führt. Während bisherige Richtlinien für gepoolte CRISPR Screens die initiale
gRNA-Bibliotheksverteilung nicht berücksichtigen, empfehlen wir die Screening Coverage an dieser auszurichten.
Autophagie ist ein streng regulierter zellulärer Prozess, der den Lysosomen Abbau von intrazellulärem Material steuert und im Zusammenhang mit zahlreichen menschlichen Erkrankungen steht. Da Autophagie in eine Vielzahl von Signalwegen integriert ist, bietet es außerdem therapeutische Ansatzpunkte zur Behandlung von Krankheiten. Die Identifizierung von synergistischen Funktionen zwischen Autophagie-Genen könnte unser Verständnis über die molekularen Mechanismen, die der Regulation der Autophagie zu Grunde liegen, erweitern und dadurch neuartige Behandlungen ermöglichen.
Um genetische Interaktionen von Autophagie-Genen zu untersuchen haben wir eine 3Cs multiplex gRNA Bibliothek generiert, die auf menschliche Autophagie-Genkombinationen
abzielt. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Funktionalität der 3Cs Autophagie multiplex gRNA Bibliothek unter Anwendung minimierter Screening Coverage in zwei verschiedenen Screen-Ausführungen: In einem Proliferationsscreen konnten wir Geninteraktionen
identifizieren, deren Verlust zu einer gesteigerten oder verringerten Zellproliferation führt. Unter diesen resultierte der Knockout von WDR45B-PIK3R4 zur stärksten Suppression der Proliferation, während die Depletion von ATG7-KEAP1 zu extrem verstärkter Proliferation beitrug. Unter Einsatz eines Autophagie-Reporters konnten wir in einem Autophagie Screen genetische Interaktionen aufdecken, die essentiell für Autophagie sind, darunter die
Interaktionen zwischen ATG2A-ATG2B , GABARAPL2-WIPI2 und ULK4-SQSTM1.
Wir glauben, dass 3Cs Multiplexing in Zukunft breite Anwendung in verschiedenen biologisch relevanten Feldern finden kann und die Entschlüsselung von kontext-abhängigen genetischen Interaktionen voranbringen und so das Verständnis für die Entstehung von komplexen pathologischen Phänotypen erweitern wird.
Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.
Methanol derived from plant tissue is ubiquitous in anaerobic sediments and a good substrate for anaerobes growing on C1 compounds such as methanogens and acetogens. In contrast to methanogens little is known about the physiology, biochemistry and bioenergetics of methanol utilization in acetogenic bacteria. To fill this gap, we have used the model acetogen Acetobacterium woodii to study methanol metabolism using physiological and biochemical experiments paired with molecular studies and transcriptome analysis. These studies identified the genes and enzymes involved in acetogenesis from methanol and the redox carriers involved. We will present the first comprehensive model for carbon and electron flow from methanol in an acetogen and the bioenergetics of acetogenesis from methanol.
Metal ions as novel polarizing agents for dynamic nuclear polarization enhanced NMR spectroscopy
(2017)
High-spin complexes of Gd(III) and Mn(II) were introduced as polarizing agents (PAs) for solid-state dynamic nuclear polarization (DNP) in 2011. This dissertation was undertaken in 2013, with the intention of exploring these PAs further. Major goals of this work were to understand their DNP mechanism(s) and explore their application in biomolecular research. This cumulative thesis details the methods, advantages, and practical implications of using high-spin PAs for MAS DNP. Data from electron paramagnetic resonance (EPR) and NMR spectroscopy are discussed for a complete understanding of DNP mechanisms.
Out of the two main mechanisms − solid effect (SE) and cross effect (CE − active under experimental conditions of solid-state DNP, commonly used nitroxide PAs evoke CE owing to their broad EPR spectra. On the other hand, DNP mechanisms evoked by high-spin metal ions seem non-trivial due to additional features (originating from spin-orbit coupling or zero field splitting) in their EPR spectra. The features of the EPR signal generally influence the shape of enhancement profiles. Therefore, the metal ion with a simpler EPR signal i.e., Gd(III) , is chosen as the starting point for the investigation of DNP mechanisms. Varying concentrations (2, 10, 20 mM) of a water-soluble and stable complex Gd-DOTA was dissolved as the PA in a glycerol-water solution of 13C,15N - urea. Field profiles of DNP enhancement on each nuclear type (1H, 13C, and 15N) establishes SE as the active DNP mechanism at the smallest PA concentration (2 mM). This confirms the theoretical predictions that narrow line width of the Gd(III) EPR signal arising from the central transition (CT, ms = -1/2 +1/2) allows for resolved SE DNP. However, that is no longer the case at higher PA concentrations of 10 and 20 mM. At higher Gd(III) concentrations, the CE mechanism contributes significantly and varies with nuclear Larmor frequency (ωn) of the concerned nuclei. The enhancement maxima shifts towards the EPR resonance as the contribution from CE increases. This shift is evident in the field profiles of 15N and 13C, whereas that of 1H is least influenced. This observation can be explained by combining theoretical estimates with the experimental data; the CE is evoked by increased dipolar coupling (Dee) – a prerequisite for CE – between neighboring Gd(III) spins as the statistical inter-spin distance shortens at elevated concentrations. This finding is important because the knowledge of active DNP mechanisms is essential for accurate interpretation of results from DNP experiments.
From the experiments on Gd-DOTA it becomes clear that concentration, inter-spin distances, and hence induced Dee are intertwined. In order to explicitly address the influence of inter-spin distances on DNP mechanisms we started a collaboration with the group of Adelheid Godt (Bielefeld). In this collaborative project, bis-complexes of the type Gd(III)-spacer-Gd(III) with variable spacer lengths were investigated. These PAs provided an excellent model system where the influence of only inter-spin distances can be determined for a fixed Gd(III) concentration. A small PA concentration of 4 mM is used to ensure absence of significant inter-molecular dipolar interactions. A mono-Gd complex of similar geometry and chemistry is taken as a reference for SE DNP.
The mono-Gd complex yields enhancements arising from SE as expected from negligible inter-molecular Dee. The contribution of CE increases as the inter-spin distances between Gd(III) ions become shorter going from 3.4 nm 2.1 nm 1.4 nm 1.2 nm due to corresponding increase in Dee. The extent of CE on ωn follows the same trend as for Gd-DOTA. Highest CE contribution is observed on nuclei with the smallest ωn 15N because smaller ωn approaches the width of the EPR signal, this is an additional requirement for CE DNP.
The field position for maximum DNP enhancement corresponding to Gd-DOTA, is used for DNP experiments on Ubiquitin with an attached Gd-tag as PA. The success of DNP on this sample illustrates the possibility of site-directed DNP with metal ions tags as PAs. As a perspective Gd-tags can be used to examine change in conformation of a protein that would give higher enhancements due to CE if two Gd(III) labeled domains are closer in space. In a separate project, Mn(II) (s=5/2) bound to the divalent site of a hammerhead ribozyme was used as a PA which resulted in the first demonstration of intra-complex DNP using an intrinsically bound metal ion PA.