Biochemie und Chemie
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Directed deposition of silicon nanowires using neopentasilane as precursor and gold as catalyst
(2012)
In this work the applicability of neopentasilane (Si(SiH3)4) as a precursor for the formation of silicon nanowires by using gold nanoparticles as a catalyst has been explored. The growth proceeds via the formation of liquid gold/silicon alloy droplets, which excrete the silicon nanowires upon continued decomposition of the precursor. This mechanism determines the diameter of the Si nanowires. Different sources for the gold nanoparticles have been tested: the spontaneous dewetting of gold films, thermally annealed gold films, deposition of preformed gold nanoparticles, and the use of “liquid bright gold”, a material historically used for the gilding of porcelain and glass. The latter does not only form gold nanoparticles when deposited as a thin film and thermally annealed, but can also be patterned by using UV irradiation, providing access to laterally structured layers of silicon nanowires.
The IrIII atom of the title compound, [Ir(C11H8N)2Cl(CH3CN)], displays a distorted octahedral coordination. The pyridyl groups are in trans positions [N—Ir—N = 173.07 (10)°], while the phenyl groups are trans with respect to the acetonitrile and chloride groups [C—Ir—N = 178.13 (11) and C—Ir—Cl = 176.22 (9)°]. The pyridylphenyl groups only show a small deviation from planarity, with the dihedral angle between the planes of the two six-membered rings in each pyridylphenyl group being 5.6 (2) and 5.8 (1)°. The crystal packing shows intermolecular C—H[cdots, three dots, centered]Cl, C—H[cdots, three dots, centered]π(acetonitrile) and C—H[cdots, three dots, centered]π(pyridylphenyl) contacts.
Nuclear Magnetic Resonance ("NMR") is a powerful and versatile technique relying on nuclei that posses a spin. Since its discovery more than 6 decades ago, NMR and related techniques has become a tool with innumerable applications throughout the fields of Physics, Chemistry, Biology and Medicine. Numerous Nobel Prizes have been awarded for work in the field and a multi billion dollar industry has developed on its basis.
One of NMR's major shortcomings is its inherent lack of sensitivity. Because it relies on the Boltzmann populations of spin states with a minuscule Zeeman splitting, this is particularly true for room temperature experiments.
As a result, in an enormous technological effort to enlarge the Zeeman splitting NMR magnets have been moving to higher and higher magnetic fields. However, even for proton spins possessing the largest magnetic moment of all nuclei, the degree of polarization that can be achieved in the strongest spectroscopic magnets available today (~24 T) at room temperature is merely ~ 8*(10 exp (-5)). In other words, this low polarization theoretically allows a sensitivity enhancement of 104 towards full polarization.
Since Magnetic Resonance Imaging ("MRI") is based on the same principle, it shares this problem with NMR. Furthermore, for technical and physiological reasons full body MRI tomographs do not reach the magnetic field strengths of spectroscopic NMR magnets, making this even more of an issue for MRI.
In consequence, MRI is chiefly restricted to detecting protons, while both MRI and NMR detection of 13C (or other low nuclei) under physiological conditions, i.e. low natural abundance of 13C and a low concentration of the respective substance, suffer from long acquisitions times that are necessary to obtain adequate signal to noise ratios ("SNR").
However, this drawb of NMR can be overcome. The enormous potential sensitivity increase of four orders of magnitude can - at least partially - be exploited by several hyperpolarization techniques, creating entirely new applications and fields of research.
These hyperpolarization techniques comprise chemical approaches like Parahydrogen Induced Polarization ("PHIP") or Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization ("Photo-CIDNP"), as well as physical techniques like optically pumped (noble) gases13, 14 or Dynamic Nuclear Polarization ("DNP"), which will be the focus of this work. A hyperpolarized substance will render a larger signal without being physically or chemically altered in any other way. It is therefore "marked" without any marker, making it an agent free contrast agent for MRI.
DNP is a technique, in which hyperpolarization of nuclear spins is achieved by microwave (\MW") irradiation of unpaired electron spins in radicals, which are coupled to these nuclei, e.g. 1H, 13C or 15N. The electron spin population is perturbed if the microwave irradiation is resonant with the electron spin transition, which affects the polarization of hyperfine-coupled close nuclei. For large microwave power (i.e. saturating the electron spin transition) the orders of magnitude larger thermal electron spin polarization is effectively transferred to these nuclear spins in the sample. For proton spins the maximum polarization gain amounts to 660, whereas for 13C the sensitivity gain can be as large as 2600. In contrast to e.g. PHIP, which is restricted to specific reaction precursors, DNP is not limited to specific nuclei or hyperpolarization target molecules, making it a very versatile technique. DNP has been first proposed by Overhauser in 1953,15 and experimentally observed shortly thereafter in metals16 and liquids,17 both being systems with mobile electrons. In the 1960s and 70s, DNP was used as a spectroscopic tool in liquids, thoroughly mapping the effect in the low field regime. As well, several other transfer mechanisms were discovered, which are active in the solid state with localized electrons, namely the solid effect the cross effect and thermal mixing. The theory for all three of these mechanisms predicts reduced transfer efficiencies at higher magnetic fields. This fact and the lack of high frequency microwave sources to excite electron spins at magnetic field strengths above 1 T, effectively relegated DNP to a position of an interesting scientifi curiosity.
In the early 1990s, DNP came to a renaissance, when DNP was performed at high field in solid state magic angle spinning ("MAS") experiments using high power gyrotron microwave sources. This pioneering work sparked a surge of new developments and applications.
As well, this success triggered attempts to investigate also the potential of DNP in the liquid state at high magnetic fields, e.g. at 3.4 T35{38 and 9.2 T. To date, DNP can be considered one of the "hot topics" in the field of magnetic resonance, bringing about special issue in magnetic resonance journals and DNP sections on magnetic resonance conferences.
This thesis deals with the development of an in-bore liquid state DNP polarizer for MRI applications operating in ow through mode at a magnetic field strength of 1.5 T. Following this introductory chapter, the theoretical background necessary to understand and interpret the experimental results is explained in chapter 2. Subsequently, chapter 3 deals with the issue of performing liquid state DNP at high magnetic fields and its challenges. The chapter comprises a quick overview of the necessary hardware, the experimental findings for various samples and the interpretation of these findings. along with the ramifications for the aim of this work. Chapter 4 deals with the issue of increasing sensitivity and contrast in MRI, in particular by means of DNP. The chapter illustrates the development of our polarizer by presenting the hardware that was developed and demonstrating its performance under various conditions. As well, several alternative approaches are introduced and compared to our approach. Finally, chapter 5 summarizes the findings and gives an outlook on further developments.
Optogenetic approaches using light-activated proteins like Channelrhodopsin-2 (ChR2) enable investigating the function of populations of neurons in live Caenorhabditis elegans (and other) animals, as ChR2 expression can be targeted to these cells using specific promoters. Sub-populations of these neurons, or even single cells, can be further addressed by restricting the illumination to the cell of interest. However, this is technically demanding, particularly in free moving animals. Thus, it would be helpful if expression of ChR2 could be restricted to single neurons or neuron pairs, as even wide-field illumination would photostimulate only this particular cell. To this end we adopted the use of Cre or FLP recombinases and conditional ChR2 expression at the intersection of two promoter expression domains, i.e. in the cell of interest only. Success of this method depends on precise knowledge of the individual promoters' expression patterns and on relative expression levels of recombinase and ChR2. A bicistronic expression cassette with GFP helps to identify the correct expression pattern. Here we show specific expression in the AVA reverse command neurons and the aversive polymodal sensory ASH neurons. This approach shall enable to generate strains for optogenetic manipulation of each of the 302 C. elegans neurons. This may eventually allow to model the C. elegans nervous system in its entirety, based on functional data for each neuron.
A series of novel mono-1,2,3-triazole and bis-1,2,3-triazole acyclonucleoside analogues of 9-(4-hydroxybutyl)guanine was prepared via copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition of N-9 propargylpurine, N-1-propargylpyrimidines/as-triazine with the azido-pseudo-sugar 4-azidobutylacetate under solvent-free microwave conditions, followed by treatment with K2CO3/MeOH, or NH3/MeOH. All compounds studied in this work were screened for their antiviral activities [against human rhinovirus (HRV) and hepatitis C virus (HCV)] and antibacterial activities against a series of Gram positive and negative bacteria.
Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1
(2011)
The respiratory chain in the inner mitochondrial membrane contains three large multi-enzyme complexes that together establish the proton gradient for ATP synthesis, and assemble into a supercomplex. A 19-Å 3D map of the 1.7-MDa amphipol-solubilized supercomplex I1III2IV1 from bovine heart obtained by single-particle electron cryo-microscopy reveals an amphipol belt replacing the membrane lipid bilayer. A precise fit of the X-ray structures of complex I, the complex III dimer, and monomeric complex IV indicates distances of 13 nm between the ubiquinol-binding sites of complexes I and III, and of 10–11 nm between the cytochrome c binding sites of complexes III and IV. The arrangement of respiratory chain complexes suggests two possible pathways for efficient electron transfer through the supercomplex, of which the shorter branch through the complex III monomer proximal to complex I may be preferred.
In the title compound, C27H37N2 +·Cl−·2CH2Cl2, the cation and the anion are each located on a crystallographic mirror plane. Both of the dichloromethane solvent molecules show a disorder across a mirror plane over two equally occupied positions. Additionally, one isopropyl group is also disordered. In the crystal, the cations are connected to the chloride ions via C—H[cdots, three dots, centered]Cl hydrogen bonds.
In the title compound, C27H37N2 +·Br−·2CH2Cl2, both the cation and the anion are located on a crystallographic mirror plane. Both of the dichloromethane solvent molecules show a disorder across a mirror plane over two equally occupied positions. In the crystal, the cations are connnected to the bromide ions via C—H[cdots, three dots, centered]Br hydrogen bonds.
Molecules of the title compound (alternative name: butane-1,4-diyl dinicotinate), C16H16N2O4, lie on a inversion centre, located at the mid-point of the central C—C bond of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. The butane chain adopts an all-trans conformation. The dihedral angle between the mean plane of the butane-3-carboxylate group [for the non-H atoms, maximum deviation = 0.0871 (15) Å] and the pyridine ring is 10.83 (7)°. In the crystal, molecules lie in planes parallel to (122). The structure features weak π–π interactions with a centroid–centroid distance of 3.9281 (11) Å.
The crystal structure of the title compound, [Fe(C5H5)(CH3CN)(CO)2]BF4, of which only the coordinates of the non-H atoms of the cation have previously been reported [Fadel et al. (1979 [triangle]). Z. Anorg. Allg. Chem. 453, 98–106] has been redetermined. The FeII atom in the complex cation is coordinated by a cyclopentadienyl ring, two carbonyl ligands and an acetonitrile molecule displaying a three-legged piano stool structure. Three of the four F atoms of the BF4 − anion are disordered over two sets of sites, with a site-occupancy factor of 0.709 (10) for the major occupied site.
A new polymorph of the title compound, [Pd2(C8H18P)2(C8H19P)2], has been found. It belongs to the triclinic P-1 space group, whereas the known form [Leoni, Sommovigo, Pasquali, Sabatino & Braga (1992 [triangle]), J. Organomet. Chem. 423, 263–270] crystallizes in the monoclinic C2/c space group. The title compound features a dinuclear palladium complex with a planar central Pd2(μ-P)2 core (r.m.s. deviation = 0.003 Å). The Pd—Pd distance of 2.5988 (5) Å is within the range of a PdI—PdI bond. The molecules of both polymorphs are located on a crystallographic centre of inversion. The molecular conformations of the two polymorphs are essentially identical. The crystal packing patterns, on the other hand, are slightly different.
Atomic-level analyses of non-native protein ensembles constitute an important aspect of protein folding studies to reach a more complete understanding of how proteins attain their native form exhibiting biological activity. Previously, formation of hydrophobic clusters in the 6 M urea-denatured state of an ultrafast folding mini-protein known as TC5b from both photo-CIDNP NOE transfer studies and FCS measurements was observed. Here, we elucidate the structural properties of this mini-protein denatured in 6 M urea performing 15N NMR relaxation studies together with a thorough NOE analysis. Even though our results demonstrate that no elements of secondary structure persist in the denatured state, the heterogeneous distribution of R2 rate constants together with observing pronounced heteronuclear NOEs along the peptide backbone reveals specific regions of urea-denatured TC5b exhibiting a high degree of structural rigidity more frequently observed for native proteins. The data are complemented with studies on two TC5b point mutants to verify the importance of hydrophobic interactions for fast folding. Our results corroborate earlier findings of a hydrophobic cluster present in urea-denatured TC5b comprising both native and non-native contacts underscoring their importance for ultra rapid folding. The data assist in finding ways of interpreting the effects of pre-existing native and/or non-native interactions on the ultrafast folding of proteins; a fact, which might have to be considered when defining the starting conditions for molecular dynamics simulation studies of protein folding.
Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden.
Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt.
Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können.
(Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.)
Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde.
(Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694)
Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen.
(Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400)
Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne?
Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert.
(Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)
Essentially any behavior in simple and complex animals depends on neuronal network function. Currently, the best-defined system to study neuronal circuits is the nematode Caenorhabditis elegans, as the connectivity of its 302 neurons is exactly known. Individual neurons can be activated by photostimulation of Channelrhodopsin-2 (ChR2) using blue light, allowing to directly probe the importance of a particular neuron for the respective behavioral output of the network under study. In analogy, other excitable cells can be inhibited by expressing Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis (NpHR) and subsequent illumination with yellow light. However, inhibiting C. elegans neurons using NpHR is difficult. Recently, proton pumps from various sources were established as valuable alternative hyperpolarizers. Here we show that archaerhodopsin-3 (Arch) from Halorubrum sodomense and a proton pump from the fungus Leptosphaeria maculans (Mac) can be utilized to effectively inhibit excitable cells in C. elegans. Arch is the most powerful hyperpolarizer when illuminated with yellow or green light while the action spectrum of Mac is more blue-shifted, as analyzed by light-evoked behaviors and electrophysiology. This allows these tools to be combined in various ways with ChR2 to analyze different subsets of neurons within a circuit. We exemplify this by means of the polymodal aversive sensory ASH neurons, and the downstream command interneurons to which ASH neurons signal to trigger a reversal followed by a directional turn. Photostimulating ASH and subsequently inhibiting command interneurons using two-color illumination of different body segments, allows investigating temporal aspects of signaling downstream of ASH.
Using an electrophysiological assay the activity of NhaA was tested in a wide pH range from pH 5.0 to 9.5. Forward and reverse transport directions were investigated at zero membrane potential using preparations with inside-out and right side-out-oriented transporters with Na+ or H+ gradients as the driving force. Under symmetrical pH conditions with a Na+ gradient for activation, both the wt and the pH-shifted G338S variant exhibit highly symmetrical transport activity with bell-shaped pH dependences, but the optimal pH was shifted 1.8 pH units to the acidic range in the variant. In both strains the pH dependence was associated with a systematic increase of the Km for Na+ at acidic pH. Under symmetrical Na+ concentration with a pH gradient for NhaA activation, an unexpected novel characteristic of the antiporter was revealed; rather than being down-regulated, it remained active even at pH as low as 5. These data allowed a transport mechanism to advance based on competing Na+ and H+ binding to a common transport site and a kinetic model to develop quantitatively explaining the experimental results. In support of these results, both alkaline pH and Na+ induced the conformational change of NhaA associated with NhaA cation translocation as demonstrated here by trypsin digestion. Furthermore, Na+ translocation was found to be associated with the displacement of a negative charge. In conclusion, the electrophysiological assay allows the revelation of the mechanism of NhaA antiport and sheds new light on the concept of NhaA pH regulation.
In der vorliegenden Dissertation stand die Aufklärung der Funktion und Regulation von p21 in der Mitose im Mittelpunkt. p21 ist als Cdk-Inhibitor und Schlüsselregulator bekannt, der in viele fundamentale zelluläre Prozesse involviert ist: Zellzyklusregulation, Apoptose, Seneszenz, Zellmigration und Dynamik des Zytoskeletts, Transkription, Differenzierung sowie DNA-Reparatur, aber auch in die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (Besson et al. 2008; Abbas und Dutta 2009; Jung et al. 2010).
Die unkontrollierte Proliferation von Zellen ist mit der Tumorgenese assoziiert und wird unter anderem durch die Fehlregulation von p21, aber auch durch die wichtigen mitotischen Kinasen Cdk1, im Komplex mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B1, sowie Plk1 bedingt. Zudem ist das Fehlen von p21 oder die Fehllokalisation in das Zytoplasma mit einer schlechteren Prognose für den Patienten und Chemotherapie-Resistenz von Tumoren verbunden (Abukhdeir und Park 2008). Aufgrund der zunehmenden Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen ist es daher von besonderem klinischem Interesse, die molekularen Ursachen für die Entstehung maligner Tumorerkrankungen aufzuklären. Bislang existieren kaum Studien über welche molekularen Mechanismen die Funktionen von p21, dem wichtigsten Cdk-Inhibitor, der zum Beispiel durch die Anwendung niedermolekularer Inhibitoren wie BI 2536, das sich bereits in klinischen Phase II Studien befindet (Strebhardt 2010), beeinflusst wird, während der Mitose reguliert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde daher die physiologische Rolle des Cdk-Inhibitors bzw. Regulators p21 während der Mitose untersucht und mit der Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1, wie auch Plk1 korreliert. Es konnte gezeigt werden, dass p21 während der Mitose stark exprimiert wird und dass mitotisches p21 in verschiedenen Krebszelllinien unabhängig von dem p53-Status in einer phosphorylierten Form vorkommt, welche mit der Aktivität von Cdk1 und weniger mit der von Cdk2 assoziiert ist. Durch Untersuchungen der isogenen HCT116-Zelllinien mit und ohne p21 wurde aufgezeigt, wie wichtig p21 für den ordnungsgemäßen Ablauf der Mitose ist. Ohne p21 sind sowohl die Anaphase wie auch die Zytokinese verlängert, die Zellen ordnen die Chromosomen fehlerhaft in der Metaphaseplatte an (congression Fehler), besitzen weitaus mehr lagging Chromosomen und fast 20 % der Zellen weisen im Versuchsverlauf Polyploidie auf. Durch den Verlust des Cdk-Regulators p21 kommt es zur Fehlregulation von Cdk1 und seiner Substrate (wie MCAK) und es treten die oben beschriebenen Probleme auf.
Weiterhin phosphoryliert Cdk1/Cyclin B1 p21 an Ser-130 in vitro und ex vivo in der frühen Phase der Mitose, der Prophase bzw. Prometaphase. Die nicht phosphorylierbare p21 Form S130A befindet sich hauptsächlich im Zellkern und führt zu vermehrtem Auftreten von congression Fehlern, während die S130D-Mutante, die die Phosphorylierung durch Cdk1 vortäuscht, schneller degradiert wird und zudem den Phänotyp der HCT116 p21-/- Zellen verstärkt. Zellen, die S130D exprimieren, benötigen mehr Zeit für das Durchlaufen der Mitose. Hier ist vor allem die Metaphase stark verlängert, aber auch Anaphase und Zytokinese. Dies führt zu congression Fehlern und zu Polyploidie. Diese Ergebnisse bestätigen, wie wichtig die zeitlich korrekte Phosphorylierung von p21 und die dadurch vermittelte Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1 ist.
Darüber hinaus stabilisiert die Suppression von Plk1 das p21 Protein, was darauf hinweist, dass die Degradation von p21 während der Prometaphase von Plk1 kontrolliert wird. Dies wird von der Tatsache unterstützt, dass Ser-114, wie auch Ser116 von Plk1 in vitro phosphoryliert wird. Die Deregulation von p21 durch Plk1, SS114/116AA bzw. SS114/116DD induziert Chromosomenfehler, wodurch die molekularen Mechanismen, warum fehlreguliertes Plk1 die Tumorgenese fördert, hervorgehoben werden.
Nach Abschluss der bisherigen Untersuchungen steht fest, dass man sich von der starren Rolle von p21 als Tumorsuppressor und Akteur während der G1/S-Phase lösen muss. Der Cdk-Inhibitor p21 trägt entscheidend zur mitotischen Progression bei, vor allem bedingt durch die zeitlich ordnungsgemäße Inaktivierung bzw. Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1, der Kinase, die wiederum zahlreiche für die Mitose essentielle Proteine reguliert. In Zukunft muss zum besseren Verständnis der Rolle von p21 in der Mitose die genaue Abfolge der Ereignisse unter Einbeziehung der Degradationsmechanismen eingehender untersucht werden.
Large crystals of the methyl ester of the N-a-benzyloxycarbonyl protected Ala-Phe dipeptide (Z-AF-OMe) were obtained after the very slow evaporation of a solution of the corresponding carboxylic acid (Z-AF-OH) in methanol containing an excess of HCl. The structure was confirmed by single crystal X-ray diffraction data. It crystallizes in the orthorhombic space group P212121 with unit cell dimensions a = 5.0655(6) Å, b = 8.4614(8) Å, c = 46.856(5) Å, V = 2008.3(4) Å3, Z = 4. In the crystal, the molecules form hydrogen bonded chains running along the a axis of the unit cell. Other secondary interactions are also discussed.
YS-121 [2-(4-chloro-6-(2,3-dimethylphenylamino)pyrimidin-2-ylthio)octanoic acid] is the result of target-oriented structural derivatization of pirinixic acid. It is a potent dual PPARα/γ-agonist, as well as a potent dual 5-LO/mPGES-1-inhibitor. Additionally, recent studies showed an anti-inflammatory efficacy in vivo. Because of its interference with many targets, YS-121 is a promising drug candidate for the treatment of inflammatory diseases. Ongoing preclinical studies will thus necessitate huge amounts of YS-121. To cope with those requirements, we have optimized the synthesis of YS-121. Surprisingly, we isolated and characterized byproducts during the resulting from nucleophilic aromatic substitution reactions by different tertiary alkylamines at a heteroaromatic halide. These amines should actually serve as assisting bases, because of their low nucleophilicity. This astonishing fact was not described in former publications concerning that type of reaction and, therefore, might be useful for further reaction improvement in general. Furthermore, we could develop a proposal for the mechanism of that byproduct formation.
Two tetrahydroisoquinoline alkaloids were extracted from the alkaloid fraction of a methanol extract of the seeds of Calycotome Villosa Subsp. intermedia. Their structures were established as (R)-1-hydroxymethyl-7-8-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydro- isoquinoline (1) and (S)-7-hydroxymethyl-2-3-dimethoxy-7,8,9,10-tetrahydroisoquinoline chloride (2) by spectroscopic techniques and X-ray diffraction analysis.
The title thiourea was synthesized by reaction of 3,4,5-trimethoxybenzoyl isothiocyante with 3-fluoroaniline. The 3,4,5-trimethoxybenzoyl isothiocyante was produced in situ by reaction of 3,4,5-trimethoxybenzoyl chloride with ammonium thiocyanate in dry acetonitrile. The structure was confirmed by the spectroscopic, elemental analysis and single crystal X-ray diffraction data. It crystallizes in the monoclinic space group P21/c with unit cell dimensions a = 13.0966(9), b = 16.6460(13), c = 7.8448(5), β = 106.721(5)°, V 1637.9(2) ų, Z = 4.
Mol-ecules of the title compound, [Zn(8)(C(6)F(5))(8)O(4)(C(4)H(10)O)(4)], are located on a special position of site symmetry [Formula: see text]. As a result, there is just one quarter-mol-ecule in the asymmetric unit. The title compound features a Zn(4)O(4) cube. Each Zn atom in the cube carries a pentafluorophenyl substituent. Each O atom is bonded to a further Zn atom, which is connected to a pentafluorophenyl substituent and the O atom of a diethyl ether mol-ecule. All ether C atoms are disordered over two sets of sites with a site occupation factor of 0.51 (2) for the major occupied site.
Molecules of the title compound, C20H14O2, show approximate C s symmetry with the approximate mirror plane perpendicular to the central ring. The torsion angles about the acyclic bonds are 30.05 (15) and 30.77 (15)° in one half compared to −36.62 (14) and −18.60 (15)° in the other half of the molecule. The central aromatic ring makes dihedral angles of 47.78 (4) and 51.68 (3)° with the two terminal rings.
The title compound, C14H20O5S·0.5H2O, crystallizes with two organic molecules and a solvent water molecule in the asymmetric unit. In both molecules, the hexapyranosyl rings adopt a slightly distorted chair conformation (5 C 2) with four substituents in equatorial positions and one substituent in an axial position. The main difference between the organic molecules is the dihedral angle between the phenyl ring and the best plane defined by the O—C1—C2—C3 atoms (r.m.s deviations = 0.003 and 0.043 Å) of the hexapyranosyl rings [47.4 (4) and 86.5 (4)°]. In the asymmetric unit, molecules are linked by two strong O—H[cdots, three dots, centered]O hydrogen bonds. In the crystal, the components are linked by a total of 10 distinct O—H[cdots, three dots, centered]O hydrogen bonds, resulting in the formation of a two-dimensional network parallel to the ab plane.
The title compound, C15H15BrO2, was synthesized by a Brønsted acid-catalysed domino electrocyclization-halogenation reaction. The five-membered ring is essentially planar (r.m.s. deviation 0.006 Å) and forms a dihedral angle of 72.7 (3)° with the attached phenyl ring. The six-membered heterocycle adopts a half-chair conformation. The crystal packing is stabilized by a C—H[cdots, three dots, centered]O contact.
The title compound, C(21)H(18)ClN, was synthesized by an enanti-oselective Brønsted acid-catalysed transfer hydrogenation reaction. The six-membered heterocycle adopts a half-chair conformation. It has the biphenyl residue in an axial position. The two rings of the biphenyl residue are almost coplanar [dihedral angle = 2.65 (9)°]. The crystal packing is stabilized by N-H⋯Cl hydrogen bonds, which connect the mol-ecules into chains running along the a axis.
The title compound, C25H20N4O2, is a ditopic ortho-hydroquinone-based bis(pyrazol-1-yl)methane ligand. The dihedral angles between the planes of the pyrazole rings and their attached phenyl rings are 17.4 (3) and 5.9 (4)°. The pyrazole rings make a dihedral angle of 87.84 (16)°. One of the two hydroxy groups forms an intramolecular hydrogen bond to the other hydroxy group, whereas the second is involved in an intermolecular O—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bond. As a result of these intermolecular hydrogen bonds, helical chains running along the b axis are formed.
The fused five- and six-membered rings in the title compound, C14H12N2O, are essentially planar, the largest deviation from the mean plane being 0.023 (2) Å. The dihedral angle between the benzimidazole mean plane and the phenyl ring is 68.50 (6)°. In the crystal, each molecule is linked to its symmetry equivalent created by a crystallographic inversion center by pairs of N—H[cdots, three dots, centered]O hydrogen bonds, forming inversion dimers.
In the mol-ecule of the title compound, C(12)H(12)BrN(3)O, the fused-ring system is essentially planar, the largest deviation from the mean plane being 0.0148 (3) Å. The two allyl groups are nearly perpendicular to the imidazo[4,5-b]pyridine plane [C-C-N-C torsion angles of 81.6 (4) and -77.2 (4)°] and point in the same direction. The planes through the atoms forming each allyl group are nearly perpendicular to the imidazo[4,5-b]pyridin-2-one system, as indicated by the dihedral angles between them of 80.8 (5) and 73.6 (5)°.
The two fused five- and six-membered rings building the molecule of the title compound, C13H10BrN3, are approximately planar, the largest deviation from the mean plane being 0.004 (2) Å. The dihedral angle between the imidazo[4,5-b]pyridine mean plane and that of the phenyl ring is 41.84 (11)°. The structure is held together by slipped π–π stacking between symmetry-related molecules, with an interplanar distance of 3.583 (1) Å and a centroid–centroid vector of 3.670 (2) Å.
The structure of the title compound, (C15H15N2O4)[AgI2], consists of an organic 4-[3-(isonicotinoyloxy)propoxycarbonyl]pyridinium cation which has a gauche–gauche (O/C/C/C—O/C/C/C or GG’) conformation and lies on a twofold rotation axis, which passes through the central C atom of the aliphatic chain, and an inorganic [AgI2]− anion. In the complex anion, the Ag+ cation is bound to two I− anions in a linear geometry. The anion was modelled assuming disorder around a crystallographic inversion centre near the location of the Ag+ cation. The crystal packing is stabilized by a strong intermolecular N—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bond, which links the cations into zigzag chains with graph-set notation C(16) running along the face diagonal of the ac plane. The N-bound H atom is disordered over two equally occupied symmetry-equivalent sites, so that the molecule has a pyridinium ring at one end and a pyridine ring at the other.
In the molecular structure of the title compound, C21H18N2O, the fused-ring system is essentially planar, the largest deviation from the mean plane being 0.0121 (9) Å. The O atom and adjacent C atom are located in Wyckoff position 4e on a twofold axis (0, y, 1/4). The two benzyl groups are almost perpendicular to the benzimidazole plane, but point in opposite directions. The dihedral angle between the benzimidazole mean plane and the phenyl ring is 81.95 (5)°, whereas that between the two benzyl groups is 60.96 (7)°.
The asymmetric unit of the title compound, C16H23ClN2O, comtains two independent molecules in which the fused-ring systems are essentially planar, the largest deviation from the mean plane of each molecule being 0.011 (2) Å and 0.016 (2) Å. The benzimidazole rings of the two molecules make a dihedral angle of 66.65 (7)°. The nonyl substituents are almost perpendicular to the benzimidazole planes [C—N—C—C tosrsion angles = 96.0 (3) and 81.0 (2)°]. In the crystal, each independent molecule forms an inversion dimer via a pair of N—H[cdots, three dots, centered]O hydrogen bonds. In one of the independent molecules, the terminal –CH2–CH3 group of the alkyl chain is disordered over two sets of sites with a refined occupancy ratio of 0.746 (7):0.254 (7).
The title compound, [Li4O4(C12H8BO)4(C4H10O)4], features a Li4O4 cube. Each Li atom in the cube is additionally coordinated by a diethyl ether molecule and each O atom in the cube carries a 9-oxa-10-boraanthracene residue. The crystal studied was a non-merohedral twin [twin law (-1 0 0 / 0 0 1 / 0 1 0); the contribution of the major twin component refined to 0.553 (3)] emulating apparent tetragonal symmetry, whereas the actual crystal system is just orthorhombic.
The crystal structure of the title compound, hexa-μ2-bromido-μ4-oxido-tetrakis[(diethyl ether)magnesium], [Mg4Br6O(C4H10O)4], determined from data measured at 173 K, differs from the previously known structure of diethyl ether magnesium oxybromide, which was determined from room-temperature data [Stucky & Rundle (1964 [triangle]). J. Am. Chem. Soc. 86, 4821–4825]. The title compound crystallizes in the tetragonal space group I An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is e-67-m1614-efi7.jpg, whereas the previously known structure crystallizes in a different tetragonal space group, namely P An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is e-67-m1614-efi7.jpg21 c. Both molecules have crystallographic An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is e-67-m1614-efi7.jpg symmetry and show almost identical geometric parameters for the Mg, Br and O atoms. The crystal of the title compound turned out to be a merohedral twin emulating a structure with apparent Laue symmetry 4/mmm, whereas the correct Laue group is just 4/m. The fractional contribution of the minor twin component converged to 0.462 (1).
The title compound, C26H18BrNO4, features a functionalized chromene. The cyclohexene ring adopts a sofa conformation and has the nitro group and the bromophenyl ring in an axial position. The ten atoms of the chromene moiety lie close to a common plane (r.m.s. deviation = 0.066 Å). The attached phenyl ring is twisted by 32.89 (10)° from the chromene plane. The crystal packing is stabilized by C—H[cdots, three dots, centered]O interactions.
The title molecule, C17H25N3O3, is built up from fused six- and five-membered rings linked to a –C10H21 chain. The fused-ring system is essentially planar, the largest deviation from the mean plane being 0.009 (2) Å. The chain is roughly perpendicular to this plane, making a dihedral angle of 79.5 (2)°. In the crystal, N—H[cdots, three dots, centered]O hydrogen bonds build infinite chains along [010]. There are channels in the structure containing disordered hexane. The contribution of this solvent to the scattering power was suppressed using the SQUEEZE option in PLATON [Spek (2009 [triangle]). Acta Cryst. D65, 148–155].
The title compound, C(19)H(14)ClNO(3)·0.2H(2)O, crystallizes with five mol-ecules and a disordered water mol-ecule in the asymmetric unit. Four of the five mol-ecules form hydrogen-bonded dimers via N-H⋯O hydrogen bonds towards another symmetry-independent mol-ecule, whereas the fifth mol-ecule forms a hydrogen-bonded dimer with its symmetry equivalent, also via N-H⋯O hydrogen bonds. The dihedral angle between the planes of the fused benzene ring and the five-membered ring to which it is attached is 79.45 (13), 49.00 (15), 72.49 (16), 81.91 (18) and 76.38 (16)° for the five mol-ecules in the asymmetric unit.
The structure of the title compound, C14H12N2O2 {systematic name: 2,2′-[hydrazinediylidenebis(methanylylidene)]diphenol}, has already been determined in the triclinic space group P An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is e-68-0o255-efi1.jpg with Z = 4 [El-Medani, Aboaly, Abdalla & Ramadan (2004 [triangle]). Spectrosc. Lett. 37, 619–632]. However, the correct space group should be P21/c with Z = 4. This structure is a new polymorph of the already known monoclinic polymorph of salicyladehyde azine, which crystallizes in space group P21/n with Z = 2. The benzene rings form a dihedral angle of 46.12 (9)°. Two intramolucular O—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bonds occur.
In the title compound, C15H14N2O4, (I), the molecule lies on a twofold rotation axis which passes through the central C atom of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. The structure is a monoclinic polymorph of the triclinic structure previously reported [Brito, Vallejos, Bolte & López-Rodríguez (2010). Acta Cryst. E66, o792], (II). The most obvious difference between them is the O/C/C/C—O/C/C/C torsion angle [58.2 (7)° in (I) and 173.4 (3)/70.2 (3)° in (II) for GG and TG conformations, respectively]. Another important difference is observed in the dihedral angle between the planes of the aromatic rings [86.49 (7)° for (I) and 76.4 (3)° for (II)]. The crystal structure features a weak π–π interaction [centroid–centroid distance = 4.1397 (10)Å]; this latter kind of interaction is not evident in the triclinic polymorph.
In the title compound, [Ag(BF4)(C14H12N2O4)]n, the coordination of the Ag+ ion is trigonal–bipyramidal with the N atoms of two ethane-1,2-diyl bis(pyridine-3-carboxylate) ligands in the apical positions and three F atoms belonging to different tetrafluoridoborate anions in the equatorial plane. The material consists of infinite chains of [Ag(C14H12N2O4)] units running along [001], held together by BF4 − bridging anions.
The title complex, [PdCl2(C18H15P)2]·0.5C6H6, has the PdII ion in a square-planar coordination mode (r.m.s. deviation for Pd, P and Cl atoms = 0.024 Å) with the PPh3 and Cl ligands mutually trans. The benzene solvent molecule is located about a crystallographic inversion centre. The title complex is isostructural with trans-dichloridobis(triphenylphosphane)palladium(II) 1,4-dichlorobenzene sesquisolvate [Kitano et al. (1983 [triangle]). Acta Cryst. C39, 1015–1017].
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist eines der Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese. Sie katalysiert zunächst die Umsetzung der freigesetzten Arachidonsäure(AA) zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HpETE), in einem zweiten Reaktionsschritt wandelt sie diese in Leukotrien A4 (LTA4) um. Leukotriene sind potente Entzündungsmediatoren und spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen und allergischen Reaktionen. Außerdem wird die Beteiligung an verschiedenen Krebsarten kontrovers diskutiert.
Sie besteht aus 673AS, ist 78 kDa schwer und gliedert sich wie alle bisher bekannten Lipoxygenasen in eine N-terminale C2-ähnliche, regulatorische Domäne(AS 1–114) (C2ld), die für die Membran- und Calciumbindung sowie die Interaktion mit dem Coactosin-like Protein (CLP) verantwortlich ist, und in eine C-terminale, katalytische Domäne (AS 121–673), die das Nicht-Häm-gebundene Eisen im aktiven Zentrum trägt. Ein weiteres Strukturmerkmal sind zwei ATP-Bindungsregionen, eine befindet sich in der C2ld (AS 73–83), die andere auf der katalytischen Domäne (AS 193–209), das molare Verhältnis von 5-LO zu ATP konnte dabei auf 1:1 festgelegt werden [167].
Bereits 1982 wurde in einer Veröffentlichung von Parker et al. beschrieben, dass 5-LO aus Rattenzellen in Gegenwart von Calcium auf einer Gelfiltration dimerisieren kann [204], 2008 schließlich wurde von Aleem et al. publiziert, dass humane 12-LO aus Thrombozyten Dimere bilden kann [219]. Somit konnte es möglich sein, dass auch die humane 5-LO zur Dimerisierung fähig ist.
Zunächst wurde aufgereinigtes Enzym mit nativer Gelelektrophorese und anschließender Coomassiefärbung oder Western Blot untersucht, dabei konnten mehrere Banden pro Bahn detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde im Anschluss eine Gelfiltration etabliert; da die C2ld der 5-LO recht hydrophob ist, war es nötig, 0,5% T20 zum Elutionspuffer PBS/EDTA zuzusetzen, da das Enzym ansonsten unspezifisch mit dem Säulenmaterial interagiert und für seine Größe zu spät eluiert hätte. In Anwesenheit von T20 eluierte 5-LO in zwei getrennten Peaks, die exakt zu den vorher mit Referenzproteinen bestimmten Elutionsvolumina des Monomers und Dimers passten. Weiter wurde getestet, ob niedermolekulare Substanzen einen Einfluss auf das Dimerisierungsverhalten haben, allerdings konnte weder durch Ca2+noch durch ATP eine Verstärkung der Dimerisierung beobachtet werden. Dahingegen konnte, nach Vorinkubation mit GSH und Diamid, das alleinige Monomer auf der Gelfiltration nachgewiesen werden, nach Vorinkubation nur mit Diamid, lag das gesamte Protein ausschließlich als Dimer vor. Durch Gelelektrophorese mit oder ohne Zusatz von ß-Mercaptoethanol und LILBID-MS konnte die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken bestätigt werden. Ein Bindungsassay mit radioaktivem 35S-GSH konnte die kovalente Bindung des GSH an die 5-LO bestätigen. Quantifizierungsstudien mit Ellmans Reagens zeigten, dass mindestens eins der Oberflächencysteine mit GSH modifiziert wurde. Die von der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden auf enzymatische Aktivität getestet und in allen 5-LO-haltigen Fraktionen konnte Aktivität gefunden werden. Leider war es nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob das Mono- oder das Dimer aktiver war. Es liegt offenbar in einem Fließgleichgewicht vor, da erneute Injektion des Monomerpeaks im bekannten Elutionsprofil aus zwei Peaks resultierte. Außerdem führt die Anwesenheit von 0,5% T20 während des Aktivitätstests zu einer Hemmung des Enzyms und weniger detektierbaren 5-LO-Produkten; es fiel vor allem auf, dass so gut wie keinerlei trans- und epitrans-LTB4, die nicht-enzymatischen Zerfallprodukte der 5-HpETE, nachzuweisen waren. Betrachtet man die Struktur der 5-LO, so findet man zehn Cysteine an der Oberfläche; die Cysteine 159, 300, 416 und 418 liegen dabei in einem Interface. Mutiert man diese Cysteine zu Serinen, so verschwindet der Dimer-induzierende Effekt des Diamids, wohingegen die Mutante weiterhin glutathionylierbar bleibt. Interessanterweise zeigt diese Mutante auch eine wesentlich weniger ausgeprägte Hemmung durch T20. Um eine Aussage treffen zu können, ob auch 5-LO aus humanen Zellen Dimere bilden kann, wurde 5-LO-haltiger S100 aus polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) untersucht. Dabei konnte mit Western Blot und einem Aktivitätsnachweis gezeigt werden, dass die 5-LO in einem breiten Bereich von der Gelfiltration eluiert. Das deutet darauf hin, dass sie in PMNL ebenfalls dimerisiert vorliegen kann. In Gegenwart von Ca2+kam es zu einer Verschiebung der 5-LO zu höhermolekularen Gewichten, wobei dieses Phänomen nicht bei S100 aus transformierten E.coli auftrat, was auf einen gerichteten Komplex nach Calciuminduktion in PMNL hindeutet.
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit der Bindemodus von Sulindac an die 5-LO mittels Crosslinking untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig der einfache Komplex aus 5-LO und CLP abnimmt, dafür aber ein hochmolekularer Komplex, der beide Enzyme enthält, entsteht. Weder das Prodrug Sulindac noch der weitere Metabolit Sulindacsulfon oder andere Inhibitoren, die ebenfalls an der C2ld angreifen sollen, zeigten diesen Effekt. Leider konnte nicht weiter geklärt werden, was diesen Effekt verursacht, allerdings liegt die Vermutung nahe, dass es zu einer Aggregation kommt. Weitere Untersuchungen könnten wichtige Hinweise auf das Design von neuen Arzneistoffen bringen, um selektivere und damit nebenwirkungsärmere Inhibitoren zu finden.
The adaptive immune system of jawed vertebrates is based on recognition and elimination of cells that are either invaded by intracellular pathogens or malignantly transformed. One essential component of these processes is the cell surface presentation of antigenic peptides via major histocompatibility complex (MHC) class I molecules to cytotoxic T-cells (CTLs). Cells degrade defective ribosomal products and misfolded or unwanted proteins by the ubiquitin-proteasome pathway. The resulting degradation products are recognized and translocated by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the endoplasmic reticulum (ER) lumen, where they are loaded onto MHC I molecules. Assembled peptide-MHC complexes are then shuttled by the secretory pathway to the cell surface for antigen presentation to CTLs, leading in the case of viral infection or malignant transformation to lysis and apoptosis of the target cell. Due to the fact that the TAP complex represents a key control point within the antigen presentation pathway, several viruses have evolved sophisticated strategies to evade immune surveillance by interfering with TAP function.
Detailed studies of the TAP mechanism or its viral inhibition have been severely impeded by difficulties in expressing sufficient amounts of functional heterodimeric TAP complex. Thus, the overexpression of TAP in the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established for functional analysis of this important ABC complex. Biomass production was scaled up by fermentation using classical batch and feed methods. Extensive screening of optimal solubilization and purification conditions allowed the isolation of the heterodimeric transport complex. Notably, only the very mild detergent digitonin preserved TAP function. Hereby, the optimal solubilization and purification strategy yielded in 30 mg TAP transporter per liter culture. Remarkably, the protein amount was 50-fold increased compared to previously described expression/purification in cultured insect cells.
The high yield and quality of TAP produced in P. pastoris allowed an extensive analysis of substrate binding and transport kinetics of the transport complex in the membrane, its solubilized and purified state, as well as the reconstituted state. Thereby, a strong and direct effect of the lipid bilayer on ATP hydrolysis and peptide transport was discovered. These important results were extended further by successful functional reconstitution of the antigen translocation machinery in different lipid environments. For the first time, a stimulation of the transport activity by phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylethanolamine (PE) was observed, whereas cholesterol was identified as an inhibitor of TAP activity.
Purification of TAP and subsequent thin-layer chromatography (TLC)/liquid chromatography Fourier transform-mass spectrometry (LC FT-MS) fingerprinting of residual lipids exhibited specifically associated glycerophospholipids; mainly PC, PE, and PI species. Strikingly, these lipids not only represent the primary class of phospholipids of the ER but were also shown to be essential for functional reactivation of delipidated, and thus inactive, TAP. The results demonstrate that transport of antigenic peptides by the ABC transporter TAP strictly requires specific glycerophospholipids.
In addition to the biochemical characterization of heterologous produced TAP, the soluble domain of the viral inhibitor US6 from human cytomegalovirus was expressed in E. coli. Optimization of the purification and refolding strategy yielded in functional protein, with a 35-fold increased protein amount compared to previous purification procedures. Protein activity was analyzed by specific inhibition of ATP binding to TAP. Furthermore, high protein yields allowed detailed investigation of TAP-dependent spatial and mechanistic separation of MHC I restricted cross-presentation in professional antigen presenting cells (pAPC).
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.
Photoinduced electron transfer from organic dye molecules to semiconductor nanoparticles is the first and most important reaction step for the mechanism in the so called “wet solar cells” [1]. The time scale between the photoexcitation of the dye and the electron injection into the conduction band of the
semiconductor colloid varies from a few tens of femtoseconds to nanoseconds, depending on the specific electron transfer parameters of the system, e.g., electronic coupling or free energy values of donor and acceptor molecules [2–10]. We show that visible pump/ white light probe is a very efficient tool to investigate the electron injection reaction allowing to observe simultaneously the relaxation of the excited dye, the injection process of the electron, the cooling of the injected electron and the charge recombination reaction.