Biochemie und Chemie
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Mitochondrial complex I, the largest and most complicated proton pump of the respiratory chain, links the electron transfer from NADH to ubiquinone to the pumping of four protons from the matrix into the intermembrane space. In humans, defects in complex I are involved in a wide range of degenerative disorders. Recent progress in the X-ray structural analysis of prokaryotic and eukaryotic complex I confirmed that the redox reactions are confined entirely to the hydrophilic peripheral arm of the L-shaped molecule and take place at a remarkable distance from the membrane domain. While this clearly implies that the proton pumping within the membrane arm of complex I is driven indirectly via long-range conformational coupling, the molecular mechanism and the number, identity, and localization of the pump-sites remains unclear. Here, we report that upon deletion of the gene for a small accessory subunit of the Yarrowia complex I, a stable subcomplex (nb8m delta) is formed that lacks the distal part of the membrane domain as revealed by single particle analysis. The analysis of the subunit composition of holo and subcomplex by three complementary proteomic approaches revealed that two (ND4 and ND5) of the three subunits with homology to bacterial Mrp-type Na+/H+ antiporters that have been discussed as prime candidates for harbouring the proton pumps were missing in nb8m delta. Nevertheless, nb8m delta still pumps protons at half the stoichiometry of the complete enzyme. Our results provide evidence that the membrane arm of complex I harbours two functionally distinct pump modules that are connected in series by the long helical transmission element recently identified by X-ray structural analysis.
Channelrhodopsin-2 (ChR2) is widely used for rapid photodepolarization of neurons, yet, as it requires high-intensity blue light for activation, it is not suited for long-term in vivo applications, e.g. for manipulations of behavior, or photoactivation of neurons during development. We used “slow” ChR2 variants with mutations in the C128 residue, that exhibit delayed off-kinetics and increased light sensitivity in Caenorhabditis elegans. Following a 1 s light pulse, we could photodepolarize neurons and muscles for minutes (and with repeated brief stimulation, up to days) with low-intensity light. Photoactivation of ChR2(C128S) in command interneurons elicited long-lasting alterations in locomotion. Finally, we could optically induce profound changes in animal development: Long-term photoactivation of ASJ neurons, which regulate larval growth, bypassed the constitutive entry into the “dauer” larval state in daf-11 mutants. These lack a guanylyl cyclase, which possibly renders ASJ neurons hyperpolarized. Furthermore, photostimulated ASJ neurons could acutely trigger dauer-exit. Thus, slow ChR2s can be employed to long-term photoactivate behavior and to trigger alternative animal development.
The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes is a membrane protein complex that couples the catalysis of the oxidation of menaquinol to menaquinone to that of the reduction of fumarate to succinate. This is the terminal step in fumarate respiration, a form of anaerobic respiration in which oxygen is replaced by fumarate as the terminal electron acceptor in many anaerobic microorganisms. In QFR, both the heme groups (low-potential distal and high-potential proximal heme b group in transmembrane subunit C) are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of the redox enzyme. Although the reduction of fumarate by menaquinol is exergonic, it is not exergonic enough to support the generation of a transmembrane electrochemical proton potential delta p. Evidence has previously shown that this reaction is catalysed by a novel mechanism, involving the facilitation of transmembrane electron transfer by transmembrane proton transfer via an essential compensatory transmembrane proton transfer pathway ("E-pathway") which is inactive in the oxidized state of the enzyme. The two key constitutents of the the pathway are the amino acid residue Glu C180 of the transmembrane helix V (located in subunit C) and the ring C propionate of the distal heme bD. The aim of the project was to obtain, by employing a combination of time-resolved as well as static spectroscopic approaches, a detailed insight of the transmembrane electron coupled proton transfer mechanism. Minute changes in both the oxidized and reduced states of a redox protein system can be selectively and sensitively monitored by static Fourier Transformed Infrared (FTIR) difference spectroscopy. The technique employed in this context, electrochemically induced FTIR difference spectroscopy, is complemented by computer-based electrostatic calculations. In order to elucidate the catalytic mechanism of the important reactions in QFR, it is necessary to investigate these in a time-resolved manner. Rapid scan FTIR difference spectroscopy is a suitable technique that allows the course of the reaction to be monitored in a time dependent fashion. The techniques employed in this context are time-resolved (tr-FTIR) and transient absorption spectroscopy. In the following, the details of individual sub-projects are discussed in brief. ...
The ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase is a key component of several aerobic respiratory chains in different organisms. It is an integral membrane protein complex, made up of three catalytic subunits (cytochrome b, cytochrome c1 and Rieske iron sulphur protein) and up to eight additional subunits in mitochondria. The complex oxidizes one quinol molecules and reduces two cytochrome c during the Q cycle, originally described by Peter Mitchell. Electrons are split between the low and the high potential chain and protons are released on the positive side of the membrane, increasing the protonmotive force needed by the ATP-synthase for energy transduction. The cytochrome bc1 complex from P. denitrificans is a perfect model for structural and functional studies. Bacteria are easy to grow and the genetic material is readily accessible for genetic manipulation. Moreover, the P. denitrificans aerobic respiratory chain is very close to the mitochondrial one: the complexes involved in electron transfer resemble the ones found in mitochondria, but lack most of the additional subunits. As a unique feature, P. denitrificans has a strongly acidic domain at the N-terminal region of the cytochrome c1, a sequence of 150 aminoacids which does not correlate with any known protein. An analogous composition can be found in the eukaryotic cytochrome bc1 complex as a part of an accessory subunit, proposed to be involved in facilitating electron transfer between the complex and the electron acceptor cytochrome c. In order to study the function of this domain in the P. denitrificans cytochrome bc1 complex, a deletion mutant has been previously cloned and modified with an affinity tag as a C-terminal extension of cytochrome b. The complex is purified by affinity chromatography and characterized by steady-state kinetics using not only horse heart cytochrome c but also the endogenous electron acceptor, the membrane bound cytochrome c552, employed here as a soluble fragment. Steady–state kinetics indicate that the deletion of the long acidic domain had effects neither on the turnover rate nor on the apparent affinity for the substrate. To understand wether the deletion affects the reaction between the cytochrome bc1 complex and the substrate, laser flash photolysis experiments are performed, showing that the interaction observed was not changed in the complex missing the acidic domain. The results presented in this work confirm the ones previously obtained by Julia Janzon using soluble fragments of the same interaction partners. The deletion, however, affected the oligomerization state of the complex, as shown by LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ion Desorption) analysis. The wild type complex has a tetrameric structure, better described as a “dimer of dimers”. The deletion of the acidic domain on the cytochrome c1 results in the separation of the two dimers, yielding the canonical dimer. Therefore, the complex deleted in the acidic domain is used for cloning and expression of a heterodimeric complex, containing an inactivating mutation in the quinol oxidation site in only one monomer, thus allowing a selective switch-off for half the complex. Such a complex is needed for the verification of an internal regulation mechanism, the half-of-the-sites reactivity. According to it, the dimeric structure of the cytochrome bc1 complex has functional implications, since the two monomers can communicate and work in a coordinated manner. This approach confirms that substrate oxidation does effectively take place only in one of the two monomers constituting the dimer, and that the binding of substrate at the Qo and Qi site regulates the switch between active and inactive monomer. Moreover, this mechanism works also as an effective protection against the reaction of quinone intermediates with oxygen and the formation of reactive oxygen species (ROS), responsable for cellular aging. The motion of the ISP head domain is also addressed in this work; in particular the mechanism which regulates the movements towards the cytochrome c1 and the electron bifurcation at the quinol oxidation site. Laser flash kinetics in presence of several inhibitors and the substrate allow studying the response of the ISP to the binding of different species at the quinol oxidation site. The binding of ligand at the Qo site in the complex triggers the conformational switch in the ISP head domain, supporting the mechanism proposed in the literature according to which the Qo site is able to “sense” the presence of substrate and transfer the information to the ISP, regulating its mobility. The internal electron pathway between the ISP and the cytochrome c1 has been analyzed also by stopped-flow kinetics, in presence and absence of inhibitors. The results indicate that two kinetic phases describe the reduction of cytochrome c1 by the ISP, and a model for the simulation of the data is proposed.
Structured RNA regions are important gene control elements in prokaryotes and eukaryotes. Here, we show that the mRNA of a cyanobacterial heat shock gene contains a built-in thermosensor critical for photosynthetic activity under stress conditions. The exceptionally short 5´-untranslated region is comprised of a single hairpin with an internal asymmetric loop. It inhibits translation of the Synechocystis hsp17 transcript at normal growth conditions, permits translation initiation under stress conditions and shuts down Hsp17 production in the recovery phase. Point mutations that stabilized or destabilized the RNA structure deregulated reporter gene expression in vivo and ribosome binding in vitro. Introduction of such point mutations into the Synechocystis genome produced severe phenotypic defects. Reversible formation of the open and closed structure was beneficial for viability, integrity of the photosystem and oxygen evolution. Continuous production of Hsp17 was detrimental when the stress declined indicating that shutting-off heat shock protein production is an important, previously unrecognized function of RNA thermometers. We discovered a simple biosensor that strictly adjusts the cellular level of a molecular chaperone to the physiological need.
The mfl-riboswitch regulates expression of ribonucleotide reductase subunit in Mesoplasma florum by binding to 2´-deoxyguanosine and thereby promoting transcription termination. We characterized the structure of the ligand-bound aptamer domain by NMR spectroscopy and compared the mfl-aptamer to the aptamer domain of the closely related purine-sensing riboswitches. We show that the mfl-aptamer accommodates the extra 2´-deoxyribose unit of the ligand by forming a more relaxed binding pocket than these found in the purine-sensing riboswitches. Tertiary structures of the xpt-aptamer bound to guanine and of the mfl-aptamer bound to 2´-deoxyguanosine exhibit very similar features, although the sequence of the mfl-aptamer contains several alterations compared to the purine-aptamer consensus sequence. These alterations include the truncation of a hairpin loop which is crucial for complex formation in all purine-sensing riboswitches characterized to date. We further defined structural features and ligand binding requirements of the free mfl-aptamer and found that the presence of Mg2+ is not essential for complex formation, but facilitates ligand binding by promoting pre-organization of key structural motifs in the free aptamer.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a pulsed EPR method that can reliably and precisely provide structural information regarding duplex RNAs and DNAs by measuring long-range distances (1.5-7 nm) utilizing distance-dependent magnetic dipole-dipole interaction between two nitroxide spin labels. In this thesis the application field of PELDOR spectroscopy has been expanded. For the first time the global architecture of tertiary folded RNA has been mapped in vitro. Moreover, the first application of PELDOR for determining structural aspects of RNA and DNA molecules inside cells has been presented. RNA has the central role in cellular processes and gene regulation. It can adopt complex three dimensional structures, which in combination with its conformational dynamics is essential for its function as biological catalyst, structural scaffold and regulator of gene expression. Riboswitches are cis-acting RNA segments that modulate gene expression by direct binding of small molecules with high affinity and specificity. Neomycin-responsive riboswitch is an engineered riboswitch developed by combination of in vitro selection and in vivo screening. Upon insertion into the 5‟ untranslated region of mRNA and binding the cognate ligand it is able to inhibit translational initiation in yeast. Using enzymatic probing the secondary structure had been postulated comprising global stem-loop architecture with a terminal and an internal loop. In the first part of this thesis, the global conformational arrangement of this 27 nucleotides long RNA element has been studied by means of site-directed spin labeling and PELDOR spectroscopy. Spin-labeled neomycin-responsive riboswitch mutants were synthesized via a Sonogashira cross-coupling reaction between 5-membered pyrroline ring based nitroxide radical (TPA) and 5-iodo-uridine. The labeling positions were chosen outside of the binding pocket and UV melting curves revealed that spin-labeling neither disturbs the secondary structure nor interferes with ligand binding. Efficient ligand binding was proven by thermal stabilization of 20.3±3.3 oC upon addition of neomycin, as well as by cw EPR spectra. PELDOR time traces with long observation time windows and with good signal to noise ratio and modulation depth were recorded for all double-labeled samples allowing a reliable data analysis. The fact that there were no shifts in the measured distances upon addition of neomycin implied the existence of a prearranged tertiary structure of the neomycin-sensing riboswitch without a significant global conformational change induced by ligand binding. Measured distances were in very good agreement with the NMR structure of the ligand-bound state of the riboswitch indicating the intrinsic propensity of the global RNA architecture toward its energetically favored ligand-bound form at low temperature. The results harvested in this work represent the first application of PELDOR for mapping the global structure of a tertiary folded RNA. In the second part of this thesis the possibility of applying PELDOR on nucleic acids (NAs) in cellular environment has been investigated. It was shown before that global NA structure depends on matrix conditions, such as concentration of ions and small molecules, molecular crowding, viscosity and interactions with proteins. Therefore, PELDOR spectroscopy on a double-labeled 12-base pair DNA duplex, the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch has been used to obtain long-range distance constraints on such systems in Xenopus laevis oocytes and to compare them with in vitro measurements. The reduced lifetime of nitroxide spin labels under cellular conditions has been a major challenge in these measurements. Investigation of nitroxide reduction kinetics in-cell has revealed that the 5-membered pyrrolidine and pyrroline rings are significantly slower reduced compared to 6-membered piperidine ring based nitroxides. Due to prolonged lifetime of the TPA nitroxides covalently attached to NA molecules PELDOR signals could be measured with good signal-to-noise ratios up to 70 minutes of incubation time. The partial loss of coupled spin labels due to nitroxide reduction only led to a decrease in the modulation depth upon increasing the incubation time. No alterations in the measured distances between in vitro and in-cell experiments implies the existence of stable overall conformations of the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch, whereas the 12-bp duplex DNA experiences stacking in-cell but retaining the secondary structure. Thus, for the first time nanometer distance measurements were performed inside cells, clearly laying a foundation for the application of PELDOR spectroscopy to study biological processes in cells, such as diffusion, interaction with proteins and other factors or chemical reactions.
Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
Background: The automation of objectively selecting amino acid residue ranges for structure superpositions is important for meaningful and consistent protein structure analyses. So far there is no widely-used standard for choosing these residue ranges for experimentally determined protein structures, where the manual selection of residue ranges or the use of suboptimal criteria remain commonplace. Results: We present an automated and objective method for finding amino acid residue ranges for the superposition and analysis of protein structures, in particular for structure bundles resulting from NMR structure calculations. The method is implemented in an algorithm, CYRANGE, that yields, without protein-specific parameter adjustment, appropriate residue ranges in most commonly occurring situations, including low-precision structure bundles, multi-domain proteins, symmetric multimers, and protein complexes. Residue ranges are chosen to comprise as many residues of a protein domain that increasing their number would lead to a steep rise in the RMSD value. Residue ranges are determined by first clustering residues into domains based on the distance variance matrix, and then refining for each domain the initial choice of residues by excluding residues one by one until the relative decrease of the RMSD value becomes insignificant. A penalty for the opening of gaps favours contiguous residue ranges in order to obtain a result that is as simple as possible, but not simpler. Results are given for a set of 37 proteins and compared with those of commonly used protein structure validation packages. We also provide residue ranges for 6351 NMR structures in the Protein Data Bank. Conclusions: The CYRANGE method is capable of automatically determining residue ranges for the superposition of protein structure bundles for a large variety of protein structures. The method correctly identifies ordered regions. Global structure superpositions based on the CYRANGE residue ranges allow a clear presentation of the structure, and unnecessary small gaps within the selected ranges are absent. In the majority of cases, the residue ranges from CYRANGE contain fewer gaps and cover considerably larger parts of the sequence than those from other methods without significantly increasing the RMSD values. CYRANGE thus provides an objective and automatic method for standardizing the choice of residue ranges for the superposition of protein structures. Additional files Additional file 1: Dependence of Q on the order parameter rank. The quantity Qi is plotted against the order parameter rank i for 9 different protein structure bundles. Additional file 2: Dependence of P on the clustering stage. The quantity Pi is plotted against the clustering stage i for 9 different protein structure bundles. Additional file 3: Dependence of CYRANGE results on the minimal cluster size parameter my. The sequence coverage (red) and RMSD (blue) of the residue ranges determined by CYRANGE were plotted as a function of my for 9 different protein structure bundles. The dotted vertical line indicates the default value, my = 8. Where CYRANGE found two domains, the RMSD values of the individual domains are shown in light and dark blue. Additional file 4: Dependence of CYRANGE results on the domain boundary extension parameter m. See Additional File 3 for details. Additional file 5: Dependence of CYRANGE results on the minimal gap width g. See Additional File 3 for details. Additional file 6: Dependence of CYRANGE results on the relative RMSD decrease parameter delta. See Additional File 3 for details. Additional file 7: Dependence of CYRANGE results on the absolute RMSD decrease parameter delta abs. See Additional File 3 for details. Additional file 8: Dependence of CYRANGE results on the gap penalty parameter gamma. See Additional File 3 for details. Additional file 9: Correlation between the sequence coverage from CYRANGE, FindCore and PSVS, and the GDT total score, GDT_TS. Each data point represents a protein shown in Figures 3 and 4. The coverage is the percentage of amino acid residues included in the residue ranges found by the different methods. The GDT_TS value is defined by GDT_TS = (P1 + P2 + P4 + P8)/4, where Pd is the fraction of residues that can be superimposed under a distance cutoff of d Å. Additional file 10: Correlation between the RMSD value for the residue ranges from CYRANGE, FindCore and PSVS, and the GDT total score, GDT_TS. Each data point represents one protein domain. See Additional File 9 for details.
Neue Synthesestrategien als Thema des Chemieunterrichts - Experimente zur Kombinatorischen Chemie
(2010)
In der vorliegenden Dissertation wurde die experimentelle Umsetzung der Thematik Kombinatorische Chemie für den Chemieunterricht in der Sekundarstufe II ausgearbeitet. Dazu wurden geeignete Experimente erarbeitet, die einen Einblick in die Kombinatorische Chemie und somit in die neuen Arbeitmethoden der heutigen Chemie schaffen. Mit deren Hilfe gängige Synthesemethoden wie die Split and Combine-Synthese, Teabag-Methode, Spot-Methode und Pin-Methode aufgezeigt werden können und von den Schülern selbst durchgeführt werden. Als ein vorteilhaftes Modell zum Aufzeigen der Arbeitsweise der Kombinatorischen Chemie haben sich Farbstoffe erwiesen, da sie schnell darstellbar sind und keiner aufwendigen Detektion der entstandenen Produkte bedürfen. Als erstes Farbstoffsystem wurden Azofarbstoffe ausgewählt, da sie auch im fakultativen Themenbereich „Farben“ im Chemieunterricht thematisiert werden. Die Übertragung der normalerweise in Lösung hergestellten Azofarbstoffe auf die Festphasenchemie musste zuerst eine geeignete und kostengünstige Festphase gefunden werden. Hierbei haben sich im Handel erhältliche Ionenaustauscher (Harze ohne Linker), die auch zur Wasseraufbereitung verwendet werden, als geeignet herausgestellt. Die erforderlichen Reaktionsbedingungen der Lösungsreaktionen wurden erprobt, optimiert und auf die Festphasenchemie übertragen. Eine Übertragung der Syntheseprinzipien auf drei weitere Farbstoffsysteme wie der Fluoreszenzfarbstoffe der Pyrydin- und Pyrylium-Reihe sowie der Oxidationsfarbstoffe schloß sich an. Nunmehr stehen für den schulischen Einsatz, aber auch für die Ausbildung, einfache Systeme zur Verfügung, die anhand schnell und problemlos durchzuführender Experimente einen Zugang zu unterschiedlichen Methoden der Kombinatorischen Chemie vermitteln können. Dabei bieten die Experimente Anregungen für weitere Arbeiten. Als problematisch stellte sich jedoch der Zugang zu mehrstufigen kombinatorischen Synthesen auf dem Gebiet der Farbstoffe dar. Hier stößt man mit den aus didaktischen Überlegungen sehr einfach gewählten Beispielen an eine Grenze. Ergänzend wurde die Thematik Kombinatorische Chemie mit hochbegabten Schülern der Internatsschule Schloß Hansenberg und interessierten Schülern aus dem Raum Frankfurt, die an dem Projekt Science Camp teilnahmen, erprobt und das Verständnis für diese Thematik mittels eines Fragebogens untersucht. Ein direkter Vergleich beider Schülergruppen konnte aufgrund unterschiedlicher schulischer Bildung nicht vorgenommen werden, weshalb die Auswertung lediglich erste Eindrücke vermittelt. Danach ist das bisher ausgearbeitete Konzept in Lerngruppen mit hochbegabten Schülern gut einsetzbar. Ein Vergleich mit durchschnittlich leistungsstarken Lerngruppen steht noch aus. Eine wünschenswerte Erweiterung und ein Ausbau der Thematik aus Sicht der Schulchemie sollte anorganische Systeme mit einbeziehen und Strategien der Dekonvolution.
Qualität und Qualitätsmanagement in der universitären naturwissenschaftlichen Lehrerfortbildung
(2010)
Vor dem Hintergrund der politischen Entwicklungen in Hessen und der allgemeinen Debatte über Qualität im Bildungsbereich sollte im Lehrerfortbildungszentrum Chemie (lfbz-Chemie) der Universität Frankfurt am Main eine systematische Qualitätsentwicklung etabliert und dieses Vorhaben wissenschatflich begleitet werden. Die wissenschaftliche Arbeit besteht aus drei Säulen: - Eine erste, qualitative Studie sollte Qualitätskriterien und -indikatoren liefern. - In einer Fallstudie am lfbz-Chemie Frankfurt sollte die Einführung von Instrumenten des Qualitätsmanagements aus dem gewerblichen Weiterbildungsbereich beobachtet und bewertet werden. - Eine bundesweite Umfrage unter universitären Fortbildungsanbietern im naturwissenschaftlichen Bereich sollte sowohl die Struktur der anbietenden Institutionen als auch die allgemeine Einstellung der Befragten zum professionellen Qualitätsmanagement (QM) nach einem im gewerblichen Bereich geläufigen Modell (LQW) beleuchten. Die Qualitätsindikatoren und -kriterien fielen sehr spezifisch für die naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung aus. Allein die drei folgenden Bereiche erfassen zwei Drittel aller Nennungen: die „Qualität der Teamer bzw. Moderatoren“, die „Fortbildungsgestaltung“ und die „Zielgruppenorientierung (Schulbezug)“. Nimmt man die Anzahl der Indikatoren und Kriterien pro Bereich als Maßstab, fokussieren die Befragten sehr stark auf Anforderungen, die die Professionalität des Personals betreffen. Zur Orientierung für die Qualitätsarbeit am lfbz-Chemie (Fallstudie) wurde das QM-Modell LQW 2 gewählt; als kleinere Instrumente kamen die Tabellen nach dem Vorbild der Balanced Scorecard (BSC) nach Kaplan und Norton sowie die Stärken-Schwächen-Analyse zum Einsatz. Als erstes Ergebnis der Fallstudie kristallisierten sich drei Arbeitsbereiche heraus: Personalorganisation, Evaluation und Innovationen. Diese Arbeitsfelder ergänzten die identifizierten Anforderungen an Fortbildung somit um Bereiche, die eher der organisatorischen Ebene zuzuordnen sind. Es ließ sich in der Fallstudie feststellen, dass ein ganzes Qualitätsmanagementmodell wie LQW 2 nur als Anregung für den einen oder anderen, als wichtig erachteten Bereich dienen konnte, während sich kleinere Instrumente eher als handhabbar erwiesen. Außerdem konnte postuliert werden, dass - ein persönlicheres Eingehen auf die Ziele und Aufgaben der einzelnen Personen im Sinne eines Total Quality Managements vermutlich zu besseren Ergebnissen geführt hätte als die Konzentration auf allgemeine Themen und die Orientierung am eher abstrakten Modell, - Erfolge sehr nachdrücklich kommuniziert werden müssen und - möglichst eine Person aus dem Stammpersonal für den Bereich Qualität verantwortlich sein sollte. Um ergänzend zur Fallstudie zu allgemeineren Schlüssen gelangen zu können, wurde eine Charakterisierung der universitären Fortbildungsanbieter mittels Clusteranalyse mit Daten der bundesweiten Umfrage durchgeführt. Sie zeigte vier Typen von Anbietern auf. Insgesamt fanden sich neben der Gruppe der großen Anbieter, zu denen auch das lfbz-Chemie gehört, nur vergleichsweise kleine Anbieter. Die in der Fallstudie erhaltenen Ergebnisse können somit nur eingeschränkt auf die meisten Anbieter übertragen werden. Insgesamt konnten Stärken und Schwächen der universitären Anbieter identifiziert werden, mit denen sich die universitäre naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung von der gewerblichen Weiterbildung abhebt. Stärken lagen vor allem in den besonderen Kompetenzen, die an der Hochschule anzutreffen sind. Problemfelder lagen ausgerechnet hauptsächlich im Personalbereich. Als spezifische Schwächen der universitären Anbieter im Personalbereich kann z. B. die Stellung der Fortbildung als Nebenaufgabe oder der Verlust von Know-how durch die Fluktuation des Personals gelten. Auch allgemein kann ein Modell wie LQW 2 als Anregung für die Qualitätsarbeit in der universitären Lehrerfortbildung dienen, nicht jedoch umfassend umgesetzt werden. Die „kleineren“ Instrumente können dagegen eher als allgemein geeignet betrachtet werden. Während die „großen“ Anbieter durch verbesserte personelle Ressourcen für Aufgaben wie die Qualitätsarbeit unterstützt werden könnten, bietet sich für die „kleinen“ Anbieter eher die Unterstützung durch eine zentrale Stelle der Universität an, um die Fortbildungsanbieter doch noch in ein professionelles Qualitätsmanagement einbinden zu können.
Die Familie der Proteorhodopsine (PR) besteht aus Hunderten von PR Molekülen, die unter Lichteinwirkung Protonen pumpen und somit eine bedeutende Rolle für die Energiegewinnung spielen könnten. Da der pKa Wert des Proton Akzeptors der Schiff‘schen Base (SB) (~7.2) dem pH Wertes der Ozeane (~7.9) ähnelt, wird auch über eine regulatorische Funktion spekuliert. Wird in Erwägung gezogen, dass 24 000 PR Moleküle pro SAR86 Zelle vorhanden sind (Beja et al. 2001) und dass 13% der Bakterien der Meeresoberfläche PR besitzen (Sabehi et al. 2005) liefert dieses Protein wahrscheinlich einen bedeutenden Energiebeitrag neben der Photosynthese. Einblicke in den Mechanismus der Energieumwandlung erfordern sowohl die Untersuchung des Chromophores, welches die Lichtenergie absorbiert als auch der Struktur des Apoproteins, das durch die Generierung eines Protonengradienten zur Energiegewinnung beiträgt. Der Fokus der Doktorarbeit liegt auf dem Chromophor und seiner Umgebung. Eine erste Charakterisierung der SB und des Retinals erfolgt durch UV/VIS und NMR Messungen (Pfleger et al. 2008). Die 13C chemische Verschiebungen von 10,11-13C2 Retinal und die 15N chemische Verschiebung der protonierten SB, gebildet durch K231, zeigt eindeutig, dass im Grundzustand nur eine Konformation der Retinals, all-trans, vorliegt. Die 15N chemische Verschiebung weist außerdem auf eine starke Wechselwirkung der SB mit ihren Gegenionen hin. Desweiteren kann durch Messungen der 15N chemischen Verschiebung der SB bei verschiedenen pH Werten der pKa Wert der SB abgeschätzt werden, auf ~12. Diese Stabilisierung der positiv geladenen protonierten Form der SB weist auf die Existenz eines Wasserclusters hin, das durch die hohe Dielektrizitätskonstante die protonierte Form der SB stabilisieren könnte. Um zu überprüfen, ob Wasser an der SB gebunden ist, wird ein sogenanntes 15N-1H HETCOR Experiment durchgeführt. Der Bereich der 15N chemischen Verschiebung der SB korreliert mit einer Protonenresonanz bei ~5 ppm, welche im Bereich einer Wasserresonanz liegt und die durch D2O austauschbar ist. Dies indiziert eine wichtige Bedeutung von Wasser in der Nähe der SB für die Funktion von PR. Der Einfluss von Mutationen des Histidins H75 und des Aspartats D97 auf die 15N chemische Verschiebung der SB sowie die Auswirkung von Histidinmutationen auf das Chromophor deuten eine direkte Wechselwirkung von Aspartat 97 und der SB an, nicht aber eine direkte Wechselwirkung von H75 und der SB. Neben dem Chromophor ist außerdem das Signalpeptid Gegenstand der Untersuchung der Doktorarbeit. Motivation für die Untersuchung war die Inhomogenität der Proben, die im Zusammenhang mit ungleich prozessiertem PR stehen könnten. Ein zweiter Teil beschäftigt sich mit neuen Konzepten der Datenaufnahme, da das S/R in der Festkörper NMR ein limitierender Faktor darstellt. Diese beinhalten Verstärkung der Relaxation (RELOAD) sowie die Refokussierung von T2 bei Verwendung eines Prozessierungsschrittes, der „half echo alternating transformation“ (HEAT).
Die Etablierung eines HIV-1 Tiermodells ist ein großes Ziel auf dem Weg zur Entwicklung antiretroviraler Medikamente und Impfstoffe gegen HIV-1. Speziesspezifische Restriktionsfaktoren und fehlende Kofaktoren verhindern jedoch die Replikation von HIV-1 in Tieren. Restriktionsfaktoren sind Bestandteil der intrinsischen Immunität und entwickelten sich im Laufe der Evolution als Abwehrmechanismus gegen diverse Pathogene. Dazu gehören die Proteine der APOBEC3-Familie, TRIM5􀀁 und Tetherin, welche die Virusreplikation von HIV-1 an verschiedenen Punkten seines Lebenszyklus inhibieren. Koevolutionär entwickelten Retroviren Antagonisten, um die restriktive Funktion ihrer Wirtsproteine zu umgehen. Um ein replikationskompetentes, simiantropes HIV zu generieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Sequenzen vifHIV-1 und vpuHIV-1 gegen vifagm.tan aus SIVagm.tan und vpugsn/den aus den Immundefizienzviren SIVgsn und SIVden substituiert, um die Restriktion gegen A3G und Tetherin in Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze zu umgehen. Die TRIM5 vermittelte Restriktion wurde über eine Mutation in der Cyclophilin A Bindedomäne des Kapsids verhindert. Die Analyse der Vifagm.tan Funktion bestätigte den geänderten Tropismus des chimären HIV-1 bezüglich der APOBEC3G vermittelten Restriktion. Denn nach Austausch des vifHIV-1 Gens war das Virus nicht mehr in der Lage, die Aktivität des humanen APOBEC3G zu unterbinden und initiierte stattdessen die Degradation des Analogons aus der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Weiterhin konnte die erfolgreiche Klonierung des vpugsn/den Gens in HIV-1 die Aktivität der SHIV-Konstrukte gegen Tetherin der Afrikanischen Grünen Meerkatze und der Rhesusaffen ändern, wohingegen humanes Tetherin nicht mehr abgebaut werden konnte. Trotz der erfolgreichen Aktivität der konstruierten SHIVs gegen die zellulären Restriktionsfaktoren der Afrikanischen Grünen Meerkatze, replizierten die generierten chimären Viren in einer AGM Zelllinie, nicht aber in periphären mononuklearen Blutzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Ein Indiz, das für weitere strukturelle Anpassungen der Viren gegenüber ihren Wirten spricht, die zur Bildung der Spezies-Barriere beitragen und Zoonosen erschweren. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die Aktivitäten der Proteine der APOBEC3-Familie und VifHIV-1 auf ihre Regulation durch Phosphorylierung untersucht. Proteinphosphorylierungen gehören zu den wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen, um diverse Funktionen wie die Enzymaktivität, Proteininteraktionen und die zelluläre Lokalisation zu steuern. Dabei konnte die durch Yang et al. postulierte Phosphorylierung von VifHIV-1 nicht bestätigt werden. Analysen der mutmaßlichen VifHIV-1 Phosphomutanten enthüllten, dass die Funktion von VifHIV-1, die Infektiosität von HIV-1 zu gewährleisten, durch Substitution der mutmaßlichen Phosphoaminosäuren nicht beeinträchtigt wird und ebenso sämtliche Phosphomutanten die Degradation von A3G initiierten, wenn auch in unterschiedlichem Maße. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass A3C entweder in einem phosphorylierten Protein-Komplex vorliegt oder ein phosphoryliertes Protein bindet. Zudem konnte ermittelt werden, dass APOBEC3A als einziges Protein der APOBEC3-Familie nach TPA- und cAMP-Stimulation phosphoryliert wird. In vitro Kinase Studien konnten zeigen, dass die Phosphorylierung unter anderem durch ERK2 erfolgt. Es konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen der Phosphorylierung von A3A und dessen zellulärer Lokalisation, Aktivität gegen HIV-1 als auch gegen die Retrotranspositionselemente IAP und LINE-1 hergestellt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die Phosphorylierung die untersuchten Aktivitäten von APOBEC3A nicht beeinflusst oder APOBEC3A eine bisher unbekannte durch Phosphorylierung regulierte Funktion besitzt.
In mitochondrial respiration, the soluble protein cytochrome c accepts an electron from the membrane bound cytochrome bc1. The interaction between cytochrome bc1 and cytochrome c is highly transient in nature, enabling turnover numbers greater than 160 s-1. Yeast cytochrome bc1 has been successfully crystallised with bound cytochrome c with the help of an antibody fragment (Lange and Hunte 2002; Solmaz and Hunte 2008). In all crystal structures of the complex, the homodimeric cytochrome bc1 binds only one cytochrome c, with the binding site located on subunit cytochrome c1. Univalent cytochrome c binding is correlated with conformational changes of the Rieske protein head domain and subunit QCR6p. The interface of the complex is small. The haem moieties are centrally located in a mainly non-polar contact site that includes a cation–! interaction and is surrounded by complementary charged residues. The crystal structure is in agreement with the general architecture of the interfaces of transient redox complexes and also reveals several interesting features unique to the cytochrome bc1. On the basis of the crystal structures, an extensive thermodynamic and kinetic characterisation of the interaction was carried out in this work to challenge the static snapshot of the bound proteins in the crystal structure as the relevant physiological electron transfer. The thermodynamic parameters of the interaction between the redox partners were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). The association constant for cytochrome bc1 and cytochrome c in oxidised state under physiological ionic strength of 120 mM at 25 °C, was determined to be 5 " 103 M-1 by direct ITC titration. So, the partners interact with an affinity of 200 #M. In spite of the low affinity the complex has a life time ($ = 1/koff) of 5 #second, sufficiently long to enable the theoretically calculated electron transfer rates of 1.0 " 106 to 2.6 " 107 s%1 with a lifetime ($ = 1/rate) of 1-0.04 μseconds and experimentally determined rate of 7.7 " 104 s%1 with a lifetime of 13 μseconds. The low affinity makes it difficult to ascertain the stoichiometry of binding. The enthalpy of the interaction is endothermic, which is consistent with the nature of an interface where hydrophobic interactions are dominant. The enthalpy and entropy is 3.6 kJmol-1 and 83 kJmol-1K-1, respectively. The importance of key interface residues was also investigated. The role of the interface residue G89 of cytochrome c which might have a role in the dissociation of the complex has been probed by site-directed mutagenesis. The interface contains a cation-! interaction between F230 of cytochrome bc1 and R19 of cytochrome c, which is thought to provide the specificity to the interaction between the otherwise promiscuous partners. To analyse the role of this interaction pair in electron transfer, F230L and F230W mutants were used to measure direct electron transfer rates by flash photolysis and steady state kinetics. The findings indicate that another ! system can work as functional substitution of F230, while deleting the ! system has a deleterious effect on the complex formation. The inability of F230L to achieve the transient and steady state turnover rates as wild type protein indicates a scenario where the variant achieves an altered bound state with inefficient electron transfer pathways and higher edge-to-edge distance. The role of supernumerary subunit QCR6p in complex formation was investigated by steady state kinetics measurements. Subunit QCR6p does not interact directly with cytochrome c but is positioned in such a way that it could electrostatically steer cytochrome c in a reactive ensemble. The highly acidic and disordered N-terminus of QCR6p could interact with a patch of conserved lysine residues on cytochrome c. The role of subunit QCR6p has been assessed using QCR6p deleted cytochrome bc1 and a lysine variant of cytochrome c. The results show that QCR6p not only affects the kinetics of the interaction but is also important for the stability of cytochrome bc1. The kinetic and thermodynamic data obtained during this study provide evidence for the functional importance of non-catalytic cytochrome bc1 subunit QCR6p, show that the entropy driven interaction is indeed of low affinity and highly transient in nature and indicate that the interface is well suited to ensure the high turnover of the electron transfer chain where cytochrome c interacts with multiple partners using overlapping interfaces. The suggested role of the cation-! interaction as a highly specific interaction has been validated.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
The molecular conformation of the title compound, C18H18N2O3S, is stabilized by an intramolecular N—H ... O hydrogen bond. The crystal packing shows centrosymmetric dimers connected by N—H ... S hydrogen bonds. The terminal ethoxy substituents are statistically disordered [occupancy ratio 0.527 (5):0.473 (5)].
The title compound, C20H22O4S2, was synthesized by the reaction of 1,4-dibromobutene with methyl thiosalicylate. The aliphatic segment of this ligand is in an all-trans conformation. The bridging chain, –S-(CH2)4-S–, is almost planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms: 0.056 Å) and its mean plane forms dihedral angles of 16.60 (7) and 5.80 (2)° with the aromatic rings. In the crystal, the molecules are linked by weak C—H ... O interactions into chains with graph-set notation C(14) along [0 0 1]. The crystal studied was a racemic twin, the ratio of the twin components being 0.27 (9):0.73 (9).
There are two independent molecules in the asymmetric unit of the title compound, C19H24S2. In both molecules, the aliphatic segment of the ligand is in an all-trans conformation: the –S–(CH2)5–S–bridging chain is almost planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.0393 and 0.0796 Å in the two molecules) and maximally extended. Their mean planes form dihedral angles of 4.08 (6)/20.47 (6) and 2.22 (6)/58.19 (6)° with the aromatic rings in the two molecules. The crystal packing is purely governed by weak intermolecular forces.
The title compound, C14H11NO4, crystallizes with two molecules in the asymmetric unit. The major conformational difference between these two molecules is the dihedral angle between the aromatic rings, namely 36.99 (5) and 55.04 (5)°. The nitro groups are coplanar with the phenyl rings to which they are attached, the O—N—C—C torsion angles being -1.9 (3) and 1.0 (3)° in the two molecules.
The 3,5-methoxy groups in the title compound, C16H23NO4, are almost coplanar with the aromatic ring, whereas the 4-methoxy group is bent out of this plane. The three CH3—O—C—C torsion angles are -1.51 (18), 0.73 (19) and 75.33 (15)°. The cyclohexane ring adopts a chair conformation. In the crystal, molecules are connected by intermolecular N—H ... O hydrogen bonds into chains running along the b axis.
The title compound. C15H14N2O4, (I), has a gauche–gauche (O/C/C/C—O/C/C/C or GG) conformation and is a positional isomer of propane-1,3-diyl bis(pyridine-3-carboxylate), (II). The molecule of (I) lies on a twofold rotation axis, which passes through the central C atom of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. There is excellent agreement of the geometric parameters of (I) and (II). The most obvious differences between them are the O/C/C/C—O/C/C/C torsion angles [56.6 (2)° in (I) and 174.0 (3)/70.2 (3)° in (II) for GG and TG conformations, respectively] and the dihedral angle between the planes of the aromatic rings [80.3 (10)° in (I) and 76.5 (3)° in (II)]. The crystal structure is stabilized by weak C—H ... N and C—H ... O hydrogen bonding.
4-Nitrophenyl 1-naphthoate
(2010)
In the title compound, C17H11NO4, the dihedral angle between the two benzene rings is 8.66 (3)°. The nitro group is twisted by 4.51 (9)° out of the plane of the aromatic ring to which it is attached. The presence of intermolecular C—H ... O contacts in the crystal structure leads to the formation of chains along the c axis.
The title compound, C6H5NO2·C6H6O2, crystallizes with one pyridinium-2-carboxylate zwitterion and one molecule of benzene-1,2-diol in the asymmetric unit. The crystal structure is characterized by alternating molecules forming zigzag chains running along the a axis: the molecules are connected by O—H ... O and N—H ... (O,O) hydrogen bonds.
Crystals of the title compound, C12H8N2·C7H8O2, were obtained during cocrystallization experiments of a compound with two hydrogen-bond donors (2-hydroxybenzyl alcohol) with another compound containing two hydrogen-bond acceptors (phenanthroline). Unexpectedly, the two molecules do not form dimers with two O—H ... N hydrogen bonds connecting the two molecules. However, one of the hydroxy groups forms a bifurcated hydrogen bond to both phenanthroline N atoms, whereas the other hydroxy group forms an O—H ... O hydrogen bond to a symmetry-equivalent 2-hydroxybenzyl alcohol molecule. In addition, the crystal packing is stabilized by Pi – Pi interactions between the two phenanthroline ring systems, with a centroid–centroid distance of 3.570 Å.
In the crystal of the title compound [systematic name: 2-(3,5-diamino-6-chloropyrazin-2-ylcarbonyl)guanidinium chloride methanol disolvate], C6H9ClN7O+·Cl-·2CH3OH , the components are connected by N—H ... N, N—H ... Cl, N—H ... O, O—H ... Cl and O—H ... O hydrogen bonds into a three-dimensional network. The dihedral angle between the aromatic ring and the guanidine residue is 6.0 (2)°.
In contrast to the previous structure determinations of the title structure, (NH4)2[MoS4], the present determination at 173 K localized the positions of the H atoms. The title structure belongs to the beta-K2SO4 family and all the ions are located on crystallographic mirror planes. The ions are held together by N—H ... S hydrogen bonds (some of which are bifurcated), forming a three-dimensional network. One of the N atoms has nine contacts to the S atoms shorter than 4 Å, and the other has ten.
The title compound (also know as azorellanone), C20H32O2, is built up from three fused carbocycles, one five-membered ring and two six-membered rings. The five membered-ring has an envelope conformation, whereas the six-membered rings have a distorted half-chair and a twist–boat conformation. In the crystal, molecules are linked by O—H ... O interactions into zigzag chains with graph-set notation C(8) along [010]. The absolute configuration was assigned on the basis of earlier chemical studies.
The dihydropyrimidine ring of the title compound, C13H15ClN2S, adopts an envelope conformation with five almost coplanar atoms (r.m.s. deviation = 0.054 Å) and the C atom bearing the two methyl substituents deviating from this plane by 0.441 (2) Å. The best plane through the five almost coplanar atoms forms a dihedral angle of 89.56 (5)° with the benzene ring. The crystal packing is characterized by centrosymmetric dimers connected by pairs of N—H ... S hydrogen bonds.
9-Bromo-9-borafluorene
(2010)
The title compound, C12H8BBr, crystallizes with three essentially planar molecules (r.m.s. deviations = 0.018, 0.020 and 0.021Å) in the asymmetric unit: since the title compound is rigid, there are no conformational differences between these three molecules. The crystal packing resembles a herringbone pattern.
The title compound, C22H28N2O6, crystallizes with four half-molecules in the asymmetric unit: each molecule is located about a crystallographic inversion centre. The central methylene groups of two molecules are disordered over two sets of equally occupied sites. The crystal packing is characterized by sheets of molecules parallel to (114).
In the title compound, C27H19N3O4, the phenol and pyrazole rings are almost coplanar [dihedral angle = 0.95 (12)°] due to an intramolecular O—H ... N hydrogen bond, whereas the phenyl ring is tilted by 40.81 (7)° with respect to the plane of the pyrazole ring. The aromatic ring with a nitrophenoxy substituent makes a dihedral angle of 54.10 (7)° with the pyrazole ring.
The title compound, C15H14N2O4, has a trans–gauche [O/C/C/C–O/C/C/C] (TG) conformation. The angle between the planes of aromatic rings is 76.4 (3)°. The crystal structure is stabilized by van der Waals interactions and C—H ... O hydrogen bonds. The crystal used was a non-merohedral twin with a fractional contribution of the minor component of 0.443 (5).
The title compound, C8H11FN5 +·Cl-, crystallized with a monoprotonated 1-(4-fluorophenyl)biguanidinium cation and a chloride anion in the asymmetric unit. The biguanidium group is not planar [dihedral angle between the two CN3 groups = 52.0 (1)°] and is rotated with respect to the phenyl group [tau = 54.3 (3)°]. In the crystal, N—H ... N hydrogen-bonded centrosymmetric dimers are connected into ribbons, which are further stabilized by N—H ... Cl interactions, forming a three-dimensional hydrogen-bonded network.
The title compound, [Na(CF3O3S)(C12H24O6)], features a sodium cation that is coordinated by eight O atoms in an irregular hexagonal bipyramidal environment. The equatorial positions are occupied by the six O atoms of an 18-crown-6 ether ring. In the axial positions, there is one O atom of a trifluoromethanesulfonate anion and an ether O atom of a symmetry-equivalent crown ether ring. In this way, centrosymmetric dimers are formed.
The asymmetric unit of the title compound, [K(C5HF6N2)(H2O)2]n, is composed of two 3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazolide anions, two potassium cations and four water molecules. The water molecules and 3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazolide anions act as bridges between the potassium cations. Each potassium cation is surrounded by four O atoms [K—O = 2.705 (3)–2.767 (3) Å] and four F atoms [K—F = 2.870 (7)–3.215 (13) Å]. The water molecules and the 3,5-bis(trifluoromethyl)pyrazolide anions are connected by O—H ... N hydrogen bonds, forming layers in the ab plane. All –CF3 groups show rotational disorder between two orientations each.
The two rings in the title compound, C11H12N2O4S, are roughly coplanar [dihedral angle = 6.77 (8)°]. Whereas the two outer methyl groups of the three methoxy groups are almost coplanar with the aromatic ring to which they are attached [C—C—O—C torsion angles = 8.5 (3) and -8.3 (3)°], the methyl group of the central methoxy substituent is not [C—C—C—C = -78.4 (3)°]. The crystal packing is stabilized by N—H ... O hydrogen bonding.
In the title compound, C11H11N3O2, the dihedral angle between the central ethanone fragment and the 4-methoxyphenyl group is 2.9 (2)°, while that between the ethanone fragment and the triazole ring is 83.4 (2)°. The dihedral angle between the planes of the triazole and benzene rings is 81.7 (1)°. The 4-methoxyphenyl group is cis with respect to the ethanone fragment O atom across the exocyclic C—C bond. In the crystal, molecules are linked by C—H ... N interactions into C(9) chains along [001].
The central structural element of the title compound, C24H29NO2, is a carbazole unit substituted with two acetyl residues and an octyl chain. The acetyl residues are nearly coplanar [dihedral angles = 5.37 (14) and 1.0 (3)°] with the carbazole unit which is essentially planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.025 Å). The octyl chain adopts an all-trans conformation. The crystal packing is stabilized by C—H ... O hydrogen bonds.
17-Acetoxymulinic acid
(2010)
The title compound, [systematic name: 5a-acetoxymethyl-3-isopropyl-8-methyl-1,2,3,3a,4,5,5a,6,7,10,10a,10b-dodecahydro-7,10-endo-epidioxycyclohepta[e]indene-3a-carboxylic acid], C22H32O6 (I), is closely related to methyl 5a-acetoxymethyl-3-isopropyl-8-methyl-1,2,3,3a,4,5,5a,6,7,10,10a,10b-dodecahydro-7,10-endo-epidioxycyclohepta[e]indene-3a-carboxylate, (II) [Brito et al., (2008 [triangle]). Acta Cryst. E64, o1209]. There are two molecules in the asymmetric unit, which are linked by two strong intramolecular O—H ... O hydrogen bonds with graph-set motif R 2 2(8). In both (I) and (II), the conformation of the three fused rings are almost identical. The five-membered ring has an envelope conformation, the six-membered ring has a chair conformation and the seven-membered ring has a boat conformation. The most obvious differences between the two compounds is the observed disorder of the acetoxymethyl fragments in both molecules of the asymmetric unit of (I). This disorder is not observed in (II). The crystal structure and the molecular conformation is stabilized by intermolecular C—H ... O hydrogen bonds. The ability to form hydrogen bonds is different in the two compounds. The crystal studied was a non-merohedral twin, the ratio of the twin components being 0.28 (1):0.72 (1)
In the title compound, C4H7N3O·C2H6OS, creatinine [2-amino-1-methyl-1H-imidazol-4(5H)one] exists in the amine form. The ring is planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.017 Å). In the crystal, two creatinine molecules form centrosymmetric hydrogen-bonded dimers linked by pairs of N—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bonds. In addition, creatinine is linked to a dimethyl sulfoxide molecule by an N—H[cdots, three dots, centered]O interaction. The packing shows layers parallel to (120).
The title compound, [Li3(C4F9O)3(C3H6O)3], features an open Li/O cube with an Li ion missing at one corner. Three of the four bridging O atoms of the cube carry a fluorinated tert-butyl residue, whereas the fourth is part of an acetone molecule. Two of the Li atoms are further bonded to a non-bridging acetone molecule. Two of the lithium ion coordination geometries are very distorted LiO4 tetrahedra; the third could be described as a very distorted LiO3 T-shape with two distant F-atom neighbours. The Li[cdots, three dots, centered]Li contact distances for the three-coordinate Li+ ion [2.608 (14) and 2.631 (12) Å] are much shorter that the contact distance [2.940 (13) Å] between the tetrahedrally coordinated species.
The title compound, [Tl4(C4H9O)4], featuring a (Tl—O)4 cube, crystallizes with a quarter-molecule (located on a special position of site symmetry An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is e-66-m1621-efi1.jpg..) and a half-molecule (located on a special position of site symmetry 23.) in the asymmetric unit. The Tl—O bond distances range from 2.463 (12) to 2.506 (12) Å. All O—Tl—O bond angles are smaller than 90° whereas the Tl—O—Tl angles are wider than a rectangular angle.
In the crystal of the title compound, C8H8ClN3S, molecules are connected by N—H[cdots, three dots, centered]S hydrogen bonds into strips parallel to the (112) planes and running along [110]. One of the amino H atoms is not involved in a classical hydrogen bond. In addition, there is a rather short intermolecular Cl ... S distance of 3.3814 (5) Å.
In the title compound, C15H14N2O4, (I), the molecule lies on a twofold rotation axis which passes through the central C atom of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. The structure is a monoclinic polymorph of the triclinic structure previously reported [Brito, Vallejos, Bolte & López-Rodríguez (2010). Acta Cryst. E66, o792], (II). The most obvious difference between them is the O/C/C/C—O/C/C/C torsion angle [58.2 (7)° in (I) and 173.4 (3)/70.2 (3)° in (II) for GG and TG conformations, respectively]. Another important difference is observed in the dihedral angle between the planes of the aromatic rings [86.49 (7)° for (I) and 76.4 (3)° for (II)]. The crystal structure features a weak pi–pi interaction [centroid–centroid distance = 4.1397 (10)Å]; this latter kind of interaction is not evident in the triclinic polymorph.
The title compound, C15H25N5, is an aminalization product between 2,6-diacetylpyridine and 1,3-diaminopropane. It crystallizes with two independent molecules in the asymmetric unit with different conformations. In the first molecule, the methyl groups are cis oriented with respect to the pyridine ring [N—C—C—C torsion angles = 72.5 (1) and 80.3 (1)°], while they are trans oriented in the second molecule [N—C—C—C torsion angles = 82.6 (1) and -90.8 (1)°]. Each of the two molecules forms centrosymmetric dimers held together by N—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bonds, thus forming R 2 2(16) rings. The two dimers are interlinked by additional N—H[cdots, three dots, centered]N bonds into R 4 4(14) rings, building chains along the a axis. These patterns influence the orientation (either equatorial or axial) of the N—H bonds.
Seit der TIMSS- und PISA-Studie sind sie wieder einmal Thema der bildungspolitischen Diskussion: die naturwissenschaftlichen Fächer in unseren Schulen. Deutschen Schülerinnen und Schülern wird bescheinigt: Sie haben nur mangelnde Kenntnisse, verstehen zu wenig, sind nicht recht in der Lage, Fragestellungen methodisch anzugehen, und denken zu wenig darüber nach, wie sie naturwissenschaftliche Probleme lösen könnten. Aber auch viele Erwachsene geben offen zu, besonders von den »harten« Naturwissenschaften wie Chemie wenig zu verstehen und sich nie besonders dafür interessiert zu haben. Wie kommt es, dass eine Wissenschaft, die wesentlich zum Verständnis unserer stofflichen Umwelt beiträgt und deren praktische Anwendung unser tägliches Leben in hohem Maße beeinflusst, auf ein so geringes Interesse stößt?
Chemiker stehen in ihrer Mentalität Architekten nahe: Sie planen und bauen Moleküle. Schon lange, bevor der atomare Aufbau der Materie experimentell bewiesen war, entwickelten sie genaue Vorstellungen über die Raumstruktur von Molekülen. Erst zu Beginn des 20.Jahrhunderts wurden diese "Arbeitshypothesen" – zum Beispiel das von Jacobus van’t Hoff postulierte Tetraedermodell für den vierbindigen Kohlenstoff – von den Physikern glänzend bestätigt. Zwar ist es mittlerweile möglich, die Struktur von unbekannten Molekülen zuverlässig vorherzusagen; doch nach wie vor sind genaue experimentelle Strukturbestimmungen ein unverzichtbarer Bestandteil vieler Forschungsprojekte.
The analysis of biomolecular macrocomplexes requires certain preconditions to be fulfilled. The preparation of biomolecular samples usually results in low yields. Due to this constraint of low availability any method should provide a sufficient sensitivity to cope with typical sample amounts. Biomolecules also often show a reduced stability, i.e. a propensity for fragmentation upon ionisation, which requires reasonable soft methods for the investigation. Furthermore macromolecular complexes usually are composed by means of non-covalent interactions presenting additional demands on the softness. This holds true for specific complexes like protein-ligand or DNA double strand binding. For the formation of non-covalent, specific complexes the biomolecules’ native structure and environment are a basic prerequisite and hence crucial. Therefore it is desirable during analysis to keep the biomolecules in a native environment to preserve their structure and weak interactions. One suitable method for analysing biomolecules is mass spectrometry. Mass spectrometry is capable of high throughput screening as well as determining masses with high accuracy and high sensitivity. Especially since the availability of MALDI-MS and ESI-MS mass spectrometry evolved to a versatile tool to investigate biomolecular complexes. Both, MALDI- and ESI-MS are sufficiently soft methods to observe fragile biomolecules. Yet both methods have their advantages and disadvantages. During the recent years an alternative mass spectrometric approach has been developed in our group, termed LILBID-MS (Laser Induced Liquid Bead Ionisation/Desorption). In LILBID microdroplets of aqueous solution containing buffer, salt and further additives among the analyte molecules are injected into vacuum and irradiated one-by-one by mid-IR laser pulses. The absorption of the energy by the water leads to a rapid ablation of the preformed analyte ions. LILBID is highly tolerant for the addition of salts and detergents allowing to study biomolecular complexes in a native environment. As LILBID-MS is soft enough to avoid fragmentation, specific non-covalent complexes can be analysed directly from their native environment by this method. In addition dissociation can be induced on demand by increasing the laser intensity which allows for the study of subunit compositions. A further prominent property of LILBID is the possibility to study hydrophobic membrane proteins due to the tolerated use of detergents. During the course of this work, several instrumental improvements mostly concerning ion focussing and beam steering were introduced. Together with refinements of different modes of measurement the result is a significantly improved signal-to-noise ratio as well as a further improvement in sensitivity. In addition the accessible m/z range for a given flight time has been vastly increased. The new possibilities that LILBID now offers for the study of biomolecular complexes were investigated. The ability to detect specific binding in LILBID-MS was investigated by means of nucleic acids and their interaction with proteins. It could be shown that the stability of a 16bp dsDNA corresponds to that in solution phase regarding the dependency on concentration and type of the salts used. In addition a competitive experiment with the well-known transcription factor p50 was used to demonstrate the detection of sequence-specific binding with LILBID. The improved sensitivity allowed to detect single stranded DNA at nanomolar concentrations and even the 2686bp plasmid pUC19 could be easily detected without fragmentation using a concentration of only 80nM. In case of the transcription factor p63 the mass spectrometric analysis could help to identify a new model of activation and inhibition. For the first time known quarternary structures of membrane proteins like the light-driven proton pump bacteriorhodopsin and the potassium channel KcsA could be detected with mass spectrometry. For the light-driven proton pump proteorhodopsin the type and the concentration of the used detergents significantly influenced the stability of this protein as well as the preferred quarternary structure.
Die Organische Synthese – also die Kunst, aus einfachen Molekülen gezielt komplexe Moleküle herzustellen – war immer schon sowohl von akademischem als auch von industriellem Interesse, wie schon die Anfänge der Farbenindustrie beweisen. Ohne organische Synthese wäre eine Indigoproduktion oder die Herstellung von Anilinfarben aus Steinkohlenteer zu Beginn des vergangenen Jahrhunderts undenkbar gewesen. Die enge Verbindung zwischen Wissenschaft und Technologie auf dem Gebiet der organischen Synthese zieht sich wie ein roter Faden durch die Chemie bis hin zu den aktuellen biologischen oder materialwissenschaftlichen Fragestellungen. So ist die Entwicklung von Wirkstoffen – sei es für Arznei- oder Pflanzenschutzmittel – auch heute ohne organische Synthese undenkbar.
Lipide sind essentielle Strukturelemente von Zellen. Sie sind unter anderem Hauptbestandteil von Membranen, die einerseits verschiedene Kompartimente innerhalb der Zelle gegeneinander abgrenzen und andererseits die Zelle nach außen abschotten. Membranen regulieren den Transport von Ionen, kleinen polaren Molekülen sowie peptidartigen Botenstoffen, da sie für viele Bestandteile des Organismus nicht oder nur wenig durchlässig (permeabel) sind.
Wie findet man einen neuen Wirkstoff? Die pharmazeutisch-chemische Forschung steht mit diesem Vorhaben vor einer scheinbar unlösbaren Aufgabe, denn der "chemische Raum" aller wirkstoffartigen Moleküle ist unvorstellbar groß. So wurde geschätzt, dass man prinzipiell aus 1060 bis 10100 verschiedenen Verbindungen die geeigneten Kandidaten auswählen kann. Zum Vergleich: Seit dem Urknall sollen "nur" etwa 10 hoch 18 Sekunden, etwa 14 Milliarden Jahre, vergangen sein. Dies bedeutet, dass der chemische Raum praktisch unendlich ist. Aus dieser Überlegung lassen sich zumindest zwei Schlussfolgerungen ziehen: Zum einen gibt es die begründete Hoffnung, dass ein Molekül mit der gewünschten Aktivität existiert, zum anderen stellt sich die Frage, wie diese unvorstellbar große Zahl chemischer Verbindungen systematisch durchmustert werden kann? Doch die Situation ist nicht so hoffnungslos, wie sie auf den ersten Blick erscheint. Dies zeigt die erfolgreiche Entwicklung immer neuer Medikamente. Das Forschungsgebiet der Chemieinformatik befasst sich mit der Entwicklung von intelligenten Lösungsansätzen, die Chemikern bei dieser Suche nach den "Nadeln im riesigen Heuhaufen" helfen können.
Bei jeder chemischen Reaktion werden Bindungen gebrochen und andere neu geknüpft. Dabei ändert sich die Anordnung und eventuell Anzahl der Atome im Molekül. Voraussetzung hierfür sind Bewegungen der beteiligten Atome und Moleküle. Um chemische Umwandlungen in "Echtzeit" zu studieren, müssen Untersuchungen im Zeitbereich der Schwingungs- und Rotationsdynamik durchgeführt werden. Dazu nutzen Wissenschaftler des Instituts für Physikalische und Theoretische Chemie die Möglichkeiten der modernen Ultrakurzzeit-Lasertechnik.
Die Hämophile ist eine X-chromosomal vererbbare Blutungserkrankung, die durch einen funktionellen Mangel der Gerinnungsaktoren Faktor VIII oder Faktor IX im Fall der Hämo-philie A oder Hämophilie B hervorgerufen wird. Der niedrige therapeutische Schwellenwert in der Behandlung der Hämophilie (Faktorenspiegel >1%) macht diese Krankheit zu einem idealen Zielobjekt in der Gentherapie. Eine schwerwiegende Komplikation in der Behandlung der Hämophilen besteht in der Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen das the-rapeutisch substituierte Protein. Akute Blutungen in solchen Hemmkörper-Patienten werden derzeit durch FVIII- und FIX-unabhängigen Bypass-Agenzien kontrolliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einer erfolgten Optimierung eines nicht-viralen Ansatzes zur Transgenex-pression von FIX in der Leber der Maus dieses Gentransfersystem dazu verwendet, um eine Entwicklung von neuen, auf FIX basierenden, FVIII-Bypass-Strategien in vivo zu ermöglichen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Plasmidvektoren und Vektorrückgrat-freie Minicircle-Konstrukte auf ihre Effizienz zur Expression des FIX-Transgens nach hydrodyna-misch basiertem Gentransfer in die Leber der Maus untersucht. Der Gentransfer der Mini-circle führte hierbei zu einer höheren Transgenexpression und einem geringeren Abfall der FIX-Antigen-Spiegel über die Zeit. Darüber hinaus war das FIX-Protein selbst bei den höchs-ten Expressionsleveln (700% des physiologischen Levels) völlig funktional aktiv. Der Abfall der Transgenexpression über die Zeit konnte größtenteils auf den Verlust des Vektors zurück-geführt werden. Ein signifikanter Silencing-Effekt konnte nur in den Plasmidvektor- und nicht in den Minicircle-behandelten Gruppen beobachtet werden. Diesbezüglich wurde nach 100 Tagen Persistenz der nicht-viralen Vektoren in der Mausleber eine signifikante Akkumulation an CpG-Methylierungen in regulatorischen Sequenzen des hAAT-Promoters im Plasmidvek-tor gegenüber den Minicirclen ermittelt. Außerdem konnte ebenfalls eine Demethylierung von Cytosin-Nukleotiden in bakteriellen Dcm-Sequenzmotiven über die Zeit beobachtet werden, die eine signifikant höhere Rate für das Minicircle-Konstrukt im hAAT-Promoter aufwies. Die erprobten nicht-viralen Vektoren versprechen somit eine ausreichende Effizienz, um eine Translation in den Menschen, z. B. über eine spezifische Behandlung von Lebersegmenten, möglich erscheinen zu lassen. Die Methylierungsanalyse von Promoterelementen auf Sequenzebene erbrachte zudem konkrete Ansätze zum Design von nicht-viralen Vektoren mit einer noch stabileren FIX-Expression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Screening-Systems zur Aktivitätstestung von rekombinant exprimierten FIX-Varianten die Mutation K265T als die entscheidende Sub-stitution im 99-loop identifiziert, welche die FVIII-unabhängige Aktivität im FIX-Protein unter physiologischen Bedingungen begünstigt. Das Wildtyp- IX-Protein braucht hingegen FVIII um eine 106-fache Steigerung seiner proteolytischen Aktivität zu erreichen. Durch Kombination der Mutation K265T mit V181I und I383V konnte diese spezifische FVIII-Bypass-Aktivität in der resultierenden FIX-Variante (ITV) auf 15,6% (verglichen zu FIX in Anwesenheit von FVIII) gesteigert werden. Durch Inkubation der FIX-Varianten mit Plasma-proben aus Hemmkörper-Patienten konnte die Funktionalität der FIX-Varianten selbst in der Anwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern demonstriert werden. Durch Untersu-chungen des Aktivierungszustands von FIX konnte zudem gezeigt werden, dass die im Rah-men dieser Arbeit generierten FIX-Varianten nicht voraktiviert sind und die messbare FVIII-Bypass-Aktivität FIX spezifisch ist. Darüber hinaus konnte hier erstmals eine hämostatische Effizienz von FIX-Varianten mit einer FVIII-unabhängigen Aktivität in einem relevanten Krankheitsmodel demonstriert werden. Diesbezüglich resultierte der nicht-virale Gentransfer der FIX-Varianten in FVIII-K.O.-Mäusen in einer dosisabhängigen Verkürzung der aPTT-basierenden Gerinnungszeit und in einer Reduktion des Blutverlustes im tail-clip-Assay in An- oder Abwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern. Desweiteren konnte zudem mittels Vakzinierung von FIX-WT-tolerierten Mäusen mit den FIX-Varianten demonstriert werden, dass die hier eingeführten Mutationen keine hoch-immunogenen Epitope des FIX-Proteins betreffen. Schließlich konnte die Expression der FIX-Varianten in hämostatisch normalen Mäusen nicht mit der Entstehung von thromboembolischen Ereignissen selbst in einem intakten Gerinnungssystem assoziiert werden. Die hier beschriebenen FIX-Varianten könnten somit einen sicheren und effizienten Therapieansatz zur Behandlung der Hämophilie A mit inhibitorischen Antikörpern darstellen und hinsichtlich der Halbwertszeit und des möglichen throboembolischen Risikos zu einer wesentlichen Verbesserung der bereits verfügbaren Bypass-Strategien beitragen.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Seit einigen Jahrzehnten wollen Biochemiker, Mediziner, Biologen und Pharmazeuten weltweit nicht mehr auf eine bioanalytische Methode verzichten, an deren Entwicklung der Frankfurter Wissenschaftler Prof. Dr. Michael Karas vom Institut für Pharmazeutische Chemie der Goethe-Universität maßgeblich beteiligt war. Die Rede ist von der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions- / Ionisations-Massenspektrometrie – kurz MALDI-MS.
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
PERIOD proteins are central components of the Drosophila and mammalian circadian clocks. The crystal structure of a Drosophila PERIOD (dPER) fragment comprising two PER-ARNT-SIM (PAS) domains (PAS-A and PAS-B) and two additional C-terminal alpha-helices (alphaE and alphaF) has revealed a homodimer mediated by intermolecular interactions of PAS-A with tryptophane 482 in PAS-B and helix alphaF. Here we present the crystal structure of a monomeric PAS domain fragment of dPER lacking the alphaF helix. Moreover, we have solved the crystal structure of a PAS domain fragment of the mouse PERIOD homologue mPER2. The mPER2 structure shows a different dimer interface than dPER, which is stabilized by interactions of the PAS-B beta-sheet surface including tryptophane 419 (equivalent to Trp482dPER). We have validated and quantitatively analysed the homodimer interactions of dPER and mPER2 by site-directed mutagenesis using analytical gel filtration, analytical ultracentrifugation, and co-immunoprecipitation experiments. Furthermore we show, by yeast-two-hybrid experiments, that the PAS-B beta-sheet surface of dPER mediates interactions with TIMELESS (dTIM). Our study reveals quantitative and qualitative differences between the homodimeric PAS domain interactions of dPER and its mammalian homologue mPER2. In addition, we identify the PAS-B beta-sheet surface as a versatile interaction site mediating mPER2 homodimerization in the mammalian system and dPER-dTIM heterodimer formation in the Drosophila system.
The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expression of multidrug transporters which extrude a variety of lipophilic and toxic substrates in an energy dependent fashion through the membrane out of the cell. These proteins are found in all transporter families. The work described in this thesis is dedicated to drug-proton antiporters from the small multidrug resistance (SMR) family. These efflux pumps with just four transmembrane helices per monomer are so far the smallest transporters discovered. Their oligomeric state, topology, three dimensional structure, catalytic cycle and transport mechanism are still rather controversial. Therefore, the aim of this thesis was to directly address these questions for the small multidrug resistance proteins Halobacterium salinarium Hsmr and Escherichia coli (E. coli) EmrE using a number of biophysical methods such as NMR, transport assays, mass spectrometry and analytical ultracentrifugation. Especially the work on Hsmr has been challenging due to the halophilic nature of this protein. In Chapter 1, key questions and the most important biophysical techniques are introduced followed by Material and Methods in Chapter 2. Depending on experimental requirements, cell free or ‘classical’ in vivo expression has been used for this thesis. Cell free expression as an option for the production of small multidrug transporters has been explored in Chapter 3. It has been possible to produce the SMR family members Hsmr, EmrE, TBsmr and YdgF in vitro. The expression of Hsmr was investigated in more detail under different experimental conditions. Hsmr was either refolded from precipitate or maintained in a soluble form during expression in the presence of detergents and liposomes. Furthermore, amino acids for which no auxotrophic strains were available could be labelled successfully. This expression system has been also used for preparing labelled samples of EmrE as described in Chapter 9. In vivo in E. coli expression of Hsmr, as described in Chapter 4, provided large amounts of proteins if fermenter production was used. Uniform labelling and selective unlabelling with stable isotopes (13C, 15N) for NMR spectroscopy was achieved in vivo in a more efficient and cost effective manner than using the cell free approach for this protein. Hsmr could be purified successfully from both in vitro and in vivo expression media. Hsmr is expressed in vivo and in vitro with N-terminal formylation. The Nterminal formylation is unstable and Hsmr in the presence of low salt concentrations was amenable to N-terminal degradation. It was found that Hsmr shows longest stability in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, but best reconstitution conditions were found, when dodecyl maltoside is used and exchanged with Escherichia coli lipids. A molar protein lipid ratio of 1 to 100, amenable to solid state nuclear magnetic resonance, has been achieved. Sample homogeneity was shown by freeze fracture electron microscopy. The oligomeric state of Hsmr in detergent has been assessed by SDS PAGE, blue native PAGE, size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and laser induced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID) as described in Chapter 5. A concentration and detergent dependent monomer-oligomer equilibrium has been found by all methods. The activity of Hsmr under the sample preparation conditions used here was shown using radioactive and fluorescence binding as well as fluorescence and electrochemical transport assays (Chapter 6). For transport studies, a stable pH gradient was generated by co-reconstitution of Hsmr with bacteriorhodopsin and subsequent sample illumination. Based on the observed long term stability of Hsmr in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, liquid state NMR experiments were attempted in order to assess the correct folding of Hsmr in detergent micelles (Chapter 7). 1D proton and 2D HSQC spectra of U-15N Hsmr revealed a poor spectral dispersion, low resolution and only a small number of peaks. These are at least partly due to long rotational correlation times of the large protein detergent complex. This problem has been overcome by applying solid-state NMR to Hsmr reconstituted into E. coli lipids (Chapter 8). Uniform 13C labelled samples were prepared and two dimensional proton-driven spin diffusion and double quantum-single quantum correlation spectra were acquired successfully. Unfortunately, the spectral resolution was not yet sufficient for further structural studies. Reasons for the observed linebroadening could be structural heterogeneity or molecular motions which interfere with the NMR timescale. Therefore, the protein mobility has been probed using static 2H solid state NMR on Ala-d3-Hsmr. It could be shown, that parts of Hsmr are remarkably mobile in the membrane and that this mobility can be limited by the addition of the substrate ethidium bromide. Ethidium bromide as well as tetraphenylphosphonium (TPP+) is typical multidrug transporter substrates. The membrane interaction of TPP+ in DMPC membranes has been resolved by 1H MAS NMR. It was found that it penetrates into the interface region of the lipid bilayers and therefore behaves like many other transporter substrates adding to the hypothesis that the membrane could act as a pre-sorting filter. Finally, Chapter 9 is dedicated to the characterisation of the essential and highly conserved residue Glu-14 in EmrE by solid-state NMR. In order to avoid spectral overlap, the single Glu EmrE E25A mutant was chosen instead of the wildtype. The protein has been produced in vitro to take advantage of reduced isotope scrambling in the cell free expression system as verified by analytical NMR spectroscopy. Correct labelling of EmrE was tested by MALDI-TOF and solid-state NMR. The dimeric state of DDM solubilised EmrE has been probed by LILBID. The labelled protein was reconstituted into E. coli lipids to ensure a native membrane environment. Activity was determined by measuring ethidium bromide transport. Freeze fracture EM revealed very homogeneous protein incorporation even after many days of MAS NMR experiments. 2D 13C double quantum filtered experiments were used to obtain chemical shift and lineshape information of Glu-14 in EmrE. Two distinct populations were found with backbone chemical shift differences of 4 - 6 ppm which change upon substrate binding. These findings indicate a structural asymmetry at the assumed dimerisation interface and are discussed in the context of a model for shared substrate/proton binding. These studies represent the first successful use of cell free expression to prepare labelled membrane proteins for solid-state NMR and allow for the first time an NMR insight into the binding pocket of a multidrug efflux pump.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung inter- und intramolekularer Wechselwirkungen in Molekülkristallen, Ausgangspunkt sind die Kristallisation und Strukturbestimmung ausgewählter Modellverbindungen. Die einzelnen Fragestellungen werden durch geeignete Kombinationen sich ergänzender Analysenmethoden, umfangreichen Datenbank-Recherchen und quantenchemischen sowie Atompotential-Berechnungen zu beantworten versucht.
G-quadruplex topologies of telomeric repeat sequences from vertebrates were investigated in the presence of molecular crowding (MC) mimetics, namely polyethylene glycol 200 (PEG), Ficoll 70 as well as Xenopus laevis egg extract by CD and NMR spectroscopy and native PAGE. Here, we show that the conformational behavior of the telomeric repeats in X. laevis egg extract or in Ficoll is notably different from that observed in the presence of PEG. While the behavior of the telomeric repeat in X. laevis egg extract or in Ficoll resembles results obtained under dilute conditions, PEG promotes the formation of high-order parallel topologies. Our data suggest that PEG should not be used as a MC mimetic.
In this thesis, the structure of the C-terminal domain of presenilin-1, the catalytic component of the y-secretase complex, is investigated by NMR spectroscopy. The ysecretase complex has a definitive role in the pathogenic development of Alzheimer's disease, in that it mediates the cleavage of aprecursor to create the amyloid ß peptide. Aggregates of amyloid ß which form amyloid plaques are the most overt clinieal feature observed in the post-mortem brains of Alzheimer's patient. In addition, many of the mutations found in the aggressive early onset familial Alzheimer's disease have been linked to presenilin-1, highlighting its importance in disease progression and deeming it an important target for investigation. One of the greatest challenges for the structural investigation of the y-secretase components is their low expression yields in cell-based systems. We therefore applied continuous-exchange cell-free expression to obtain sufficient amounts of protein for our structural studies. An added benefit of the cell-free expression system is the freedom to incorporate any desired combination of stable-isotope labels directly into sampies. We were therefore able to develop a labeling scheme which targets the amino acid composition of transmembrane a-helices, allowing us to simplify an assignment procedure whieh tends to be cumbersome and diffieult for most a-helical transmembrane proteins. The y-secretase complex is a member of the intramembrane cleaving proteases which, as their name implies, cleave their transmembrane substrates within the bilayer. Single particle analysis of the y-secretase (1) as weil as crystal structures of rhomboid (2) and S2P (3) have revealed the presence of hydrophilie po res within the membrane where catalysis occurs. In light of evidence that certain elements of CTF reside in close proximity or even contribute to the formation of the hydrophilic pore, we chose to study the structure of CTF in mieelles, whieh may be better suited to accommodate CTF in isolation as compared with solid membranes in the absence of the other y-secretase components. The structure of CTF was solved to 1.7 A (backbone r.m.s.d) and revealed the presence of unusual features, including a partially membrane-spanning helix which situates the catalytic asparte at its N-terminus in what would be the center of the membrane where catalysis is proposed to occur, as weil as a severely kinked helix which is partially embedded beneath the surface of the membrane (P6). Interestingly, similar features have been observed in the crystal structure of the GlpG rhomboid. In addition, a soluble helix was found in the long N-terminal loop of CTF which until now has been described as unstructured. The first part of the thesis is designed to provide an introduction to Alzheimer's disease, the role of y-secretase and its presenilin-l catalytic component in disease progression, as weil as cell-free expression and liquid-state NMR techniques involved in the structural investigation of membrane proteins. In chapter 2, the reader is familiarized with the history, the clinical manifestation, and biochemical features of Alzheimer's disease. The chapter goes further to describe the role of the y-secretase complex and its individual components in disease progression and substrate processing. Chapter 3 focuses more specifically on presenilin-l in the context of the newly emerging class of intramembrane proteases. In chapter 4, attention is shifted to the cell-free expression system with special focus on the expression of membrane proteins, and chapter 5 explores the various liquid-state NMR techniques that were required for the characterization of CTF. The second part of the thesis is cumulative and contains original research, method, and review articles that were produced during the course of study. Chapter 6 explores the various techniques and innovations used to study membrane proteins using continuous exchange cell-free expression coupled with NMR spectroscopy. In chapter 7, a new technique, transmembrane segment targeted labeling, is described as a tool that facilitates the backbone assignment of transmembrane proteins which display severe overlap in NMR spectra. Chapter 8 presents the novel NMR structure of the C-terminal fragment of presenilin-l solved in SOS micelles.
Zusammenfassung der Dissertation "9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen: Ein neuartiges ditopes Hydroborierungsreagenz zum Aufbau photolumineszenter pi-konjugierter Organylborane" von Andreas Lorbach (2011) Borhaltige pi-konjugierte Verbindungen eignen sich u.a. als Chemosensoren zur Detektion von Lewis-Basen sowie als Materialien für optoelektronische Bauteile, wie z.B. organische Leuchtdioden. Vertreter dieser Substanzklasse sind Vinylborane, welche sich sehr effizient durch Addition von Hydroboranen an terminale Alkine erzeugen lassen. Diese Reaktivität nutzten Chujo et al. zum Aufbau pi-konjugierter Polymere, wobei sie Aryldiine mit sterisch anspruchsvollen Organylboranen RBH2 (R = 2,4,6-Trimethylphenyl; 2,4,6-Triisopropylphenyl; 1,1,2-Trimethylpropyl) umsetzten. Zur Detektion von Lewis-Basen sind sterisch weniger anspruchsvolle Substituenten R, die einen freien Zugang zum Boratom ermöglichen, von Vorteil. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben jedoch gezeigt, dass sich die entsprechenden Organylborane RBH2 nicht als Hydroborierungsreagenzien eignen, da sie stattdessen unter Abspaltung von Diboran spontan zu Diorganylboranen kondensieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich diese unerwünschte Substituentenübertragung durch Einbindung des Borzentrums in ein cyclisches Molekülgerüst verhindern lässt und 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen (1) somit ein isolierbares ditopes Hydroboran darstellt. Mittels eines in dieser Dissertation entwickelten dreistufigen Synthesewegs kann 1 in guten Ausbeuten aus 1,2-Dibrombenzol gewonnen werden. Im Festkörper bildet 1 eine polymere supramolekulare Struktur [1]n aus, in der die 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen-Einheiten über 2-Elektronen-3-Zentren-BHB-Bindungen miteinander verknüpft sind. Durch Umsetzung von schwerlöslichem [1]n mit Dimethylsulfid lässt sich das supramolekulare Aggregat aufbrechen und man erhält das lösliche Addukt 1(Me2S)2, das als kristallines Material in hoher Reinheit isoliert werden kann. Bei 1(Me2S)2 handelt es sich um ein hervorragendes Hydroborierungsreagenz, welches bei Raumtemperatur mit terminalen Alkinen zu den entsprechenden Vinylboranen reagiert. Aus 1 lassen sich mit Diethinylarenen außerdem lumineszente pi-konjugierte Hydroborierungspolymere erzeugen. Die Umsetzung mit bidentaten Lewis-Basen, wie z.B. Pyridazin, führt zu sehr stabilen symmetrischen Addukten, in denen die Base die beiden aziden Borzentren des Diboraanthracens verbrückt. Um einen Einblick in die elektronischen Eigenschaften des 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracens (1) zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das zu Anthracen isoelektronische dianionische Diborataanthracen ([1]2-) isoliert und hinsichtlich seiner Festkörperstruktur und Reaktivität untersucht.
NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials...
ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling pathways down-stream to the aberrant BCR/ABL fusion tyrosine kinase. Targeted inhibition of BCR/ABL by ABL-kinase inhibitors induces apoptosis in BCR/ABL transformed cells and leads to complete remission in Ph positive leukemia patients. However, a large portion of patients with advanced Ph+ leukemia relapse and acquire resistance. Kinase domain (KD) mutations interfering with inhibitor binding represent the major mechanism of acquired resistance in patients with Ph+ leukemia. Tetramerization of BCR/ABL through the N-terminal coiled-coil region (CC) of BCR is essential for the ABL-kinase activation. Targeting the CC-domain forces BCR/ABL into a monomeric conformation, reduces its kinase activity and increases the sensitivity for Imatinib. Here we show that i.) targeting the tetramerization by a peptide representing the Helix-2 of the CC efficiently reduced the autophosphorylation of both WT BCR/ABL and its mutants; ii.) Helix-2 inhibited the transformation potential of BCR/ABL independently of the presence of mutations; iii.) Helix-2 efficiently cooperated with Imatinib as revealed by their effects on the transformation potential and the factor-independence related to BCR/ABL with the exception of mutant T315I. These findings suggest that BCR/ABL harboring the T315I mutation have a transformation potential which is at least partially independent from its kinase activity. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. We definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the Helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable Helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the Helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. The T315I mutation confers resistance against all actually approved ABL-kinase inhibitors and competitive peptides. It seems not only to decrease affinity for kinase inhibitors but to confer additional features to the leukemogenic potential of BCR/ABL. To determine the role of T315I in resistance to the inhibition of oligomerization and in the leukemogenic potential of BCR/ABL, we investigated its influence on loss-of-function mutants with regard to the capacity to mediate factor-independence. Thus we studied the effects of T315I on BCR/ABL mutants lacking functional domains in the BCR portion indispensable for the oncogenic activity of BCR/ABL such as the N-terminal coiled coil (CC), the tyrosine phosphorylation site Y177 and the serine/threonine kinase domain (ST), as well as on the ABL portion of BCR/ABL (#ABL-T315I) with or without the inhibitory SH3 (delta SH3-ABL) domain. Here we report that i.) T315I restored the capacity to mediate factor independence of oligomerization_deficient p185BCR/ABL; ii.) resistance of p185-T315I against inhibition of the oligomerization depends on the phosphorylation at Y177; iii.) autophosphorylation at Y177 is not affected by the oligomerization inhibition, but phosphorylation at Y177 of endogenous BCR parallels the effects of T315I; iv.) the effects of T315I are associated with an intact ABL_kinase activity; v.) the presence of T315I is associated with an increased ABL_kinase activity also in mutants unable to induce Y177 phosphorylation of endogenous BCR; vi.) there is no direct relationship between the ABL-kinase activity and the capacity to mediate factor_independence induced by T315I as revealed by the #ABL-T315I mutant, which was unable to induce Y177 phosphorylation of BCR only in the presence of the SH3 domain. In contrast to its physiological counterpart c-ABL, the BCR/ABL kinase is constitutively activated, inducing the leukemic phenotype. The N-terminus of c-ABL (Cap region) contributes to the regulation of its kinase function. It is myristoylated, and the myristate residue binds to a hydrophobic pocket in the kinase domain known as the myristoyl binding pocket in a process called “capping”, which results in an auto-inhibited conformation. Because the cap region is replaced by the N-terminus of BCR, BCR/ABL “escapes” this auto-inhibition. Allosteric inhibition by myristate “mimics”, such as GNF-2, is able to inhibit unmutated BCR/ABL, but not the BCR/ABL that harbors the “gatekeeper” mutation T315I. Here we investigated the possibility of increasing the efficacy of allosteric inhibition by blocking BCR/ABL oligomerization. We demonstrate that inhibition of oligomerization was able not only to increase the efficacy of GNF-2 on unmutated BCR/ABL, but also to overcome the resistance of BCR/ABL-T315I to allosteric inhibition. These results strongly suggest that the response to allosteric inhibition by GNF-2 is inversely related to the degree of oligomerization of BCR/ABL. Taken together these data suggest that the inhibition of tetramerization inhibits BCR/ABL-mediated transformation and can contribute to overcome Imatinib-resistance. The study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employ-ment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo. Further the data show that T315I confers additional leukemogenic activity to BCR/ABL, which might explain the clinical behavior of patients with BCR/ABL -T315I-positive blasts. In summary, our observations establish a new approach for the molecular targeting of BCR/ABL and its resistant mutants represented by the combination of oligomerization and allosteric inhibitors.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Cytochrome c oxidase (CcO), also called Complex IV of the aerobic respiratory chain, is located in the plasma membrane of prokaryotes and in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes. The redox energy of dioxygen reduction is used to translocate protons across the membrane resulting in an electrochemical proton gradient. The generated proton gradient is exploited by the adenosine-5’-triphosphate synthase. In this work, bacterial four-subunit aa3-Type CcO from Paracoccus denitrificans (ATCC 13543, 4 SU-wt ATCC CcO) was used for analyses. 1) The recombinant homologously produced 4 SU-wt CcO (4 SU-wt rec CcO) was functionally compared with the native 4 SU-wt ATCC CcO. The 4 SU-wt rec CcO showed functional deficiencies as determined by UV-vis spectroscopy and electron paramagnetic resonance (EPR) studies. Total X-ray Reflection Fluorescence measurements show in both wild type CcOs the same ratio of the redoxactive Fe and Cu (2 Fe : 3 Cu) indicating full complement of the functional metals. If CcO contains only subunit I and II, it loses its functional integrity during continuous turnover activity. The importance of subunit III for integrity of CcO was demonstrated using 2 SU-wt rec CcO. Crystallisation trials of suicide inactivated 2 SU-wt rec CcOs have been ineffective using standard crystallisation conditions. Crystals of active 2 SU-wt rec CcO (positive control) have been obtained under these conditions and this result indicates possible structural changes in suicide inactivated 2 SU-wt rec CcO. The structure of active 2 SU-wt rec CcO was determined to 2.25 Å resolution. 2) Terminal oxidases require four electrons for the cleavage of the dioxygen bond (O=O). In general, the catalytic cycle of CcO is described by the electron input and thus by the different redox states of the metal centres: the O, E, R, P and F state. The two-electron reduced R intermediate is able to donate four electrons for dioxygen reduction forming the P state. The P intermediate is an oxoferryl state implying the lack of an electron for the R -> P transition, because the metal centres can only provide three electrons (Fe+II forms Fe+IV and Cu+II forms Cu+I). The P state, where the dioxygen bond is already broken, shows an oxoferryl state (FeIV=O2-) and a nearby tyrosine is proposed to form a tyrosyl radical representing the donor of the missing electron. H2O2-induced artificial intermediates provide the opportunity to investigated different catalytic intermediates in detail. Mixing equimolar amounts of H2O2 to CcO in the O state induces the "two-electron" reduced PH state at high pH and the electronically equal "two-electron" reduced F• H state at low pH. The addition of an excess amount of H2O2 leads to the three-electron reduced FH state. Functional studies using the 4 SU-wt ATCC CcO have demonstrated a bound peroxide (O- - O-) intermediate during the catalytic cycle. Using EPR it was previously shown that Y167 hosts a radical species in PH/F• H state which suggests that Y167 could provide this "missing electron". While X-ray structural models of CcO and Fourier-transformed infrared (FTIR) measurements of oxygenated ("pulsed") 4 SU-wt ATCC CcO suggest a bound peroxide in the O state, UV-vis and EPR spectroscopic studies indicate that other intermediates may also contain such peroxide species. Equimolar and excess amounts of H2O2 induce the PH/F• H and FH states, respectively and catalase treatment of the FH state leads, contrary to the natural direction of the catalytic cycle, to the apparent transition of the FH -> PH/F• H states, which is accompanied by reappearance of an EPR signal from the Y167• radical. The novel PFH/F• FH states are presented here and we postulate that the FH state hosts a superoxide (or peroxide) adduct at CuB in the binuclear site. In addition, the novel P10 state is also introduced having a maximum at lambda = 612 nm in the difference absorption spectrum (minus the O state). The P10 state is induced by mixing CcO in the O state with a pH 10 buffer. This pH 10 induced state resembles standard P states such as PCO, PH and PR. However, the P10 state evolves out of the O state without addition of reduction equivalents. Using EPR spectroscopy it was shown that Y167 hosts a radical species in the P10 state such as in the PH state. In summary, all functional data presented here provide evidence for a peroxide bound during the O state. Finally, a new model for the natural catalytic cycle is proposed. If the O state contains a peroxide, it is also likely that the E and R state contain this species. Even the oxoferryl intermediates P and F states may complex a peroxide at CuB in the binuclear site. 3) The amino acid residue Y167, which hosts the radical in the PH/F•H states, is not directly part of the binuclear site of CcO. For identification of the primary electron donor, two tryptophan variants of CcO, W272F and W164F, which are located nearby the binuclear site, were produced. Evidence is provided that W272 is a kinetically fast electron donor for the O2 molecule. The electron is replenished by Y167, or probably by Y280 in the natural cycle. The Y167 radical is detectable by EPR spectroscopy after treatment with equimolar amounts of H2O2 in the active variant W164F, but is absent in the inactive variant W272F. 4) CcO contains two proton conducting pathways, the D- and the K-pathway. Proteoliposomes of the variants H28A and D30N, mutations located at the entrance of the D-pathway, both show the identical proton pumping activity as the 4 SU-wt rec CcO (pumped H+/e- = 1). The variant N113D shows abolished proton pumping (pumped H+/e- = 0), but a relative high cytochrome c oxidation activity (63 %). G196D displays no cytochrome c oxidation and proton pumping activity. Overall, the addition or removal of a negative charge within the D-pathway such as in D124N, N131D, N113D and G196D leads to a decoupled phenotype indicating the high degree of electrostatic coupling in CcO.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Succinate:quinone oxidoreductases (SQORs) are integral membrane protein complexes, which couple the two-electron oxidation of succinate to fumarate (succinate → fumarate + 2H+ + 2e-) to the two-electron reduction of quinone to quinol (quinone + 2H+ + 2e- → quinol) as well as catalyzing the opposite reaction, the reduction of fumarate by quinol. In mitochondria and some aerobic bacteria, succinate:ubiquinone reductase, also known as complex II of the aerobic respiratory chain or as succinate dehydrogenase from the tricarboxylic acid (TCA or Krebs) cycle, catalyzes the oxidation of succinate by ubiquinone, which is mildly exergonic under standart conditions and not directly associated with energy storage in the form of a transmembrane electrochemical proton potential (Δp). Gram-positive bacteria do not contain ubiquinone but rather menaquinone, a quinone with significantly lower oxidation-reduction (“redox”) midpoint potential. In these cases, the catalyzed oxidation of succinate by quinone is endergonic under standard conditions. Consequently, these bacteria face a thermodynamic problem in supporting the catalysis of this reaction in vivo. Based on experimental evidence obtained on whole cells and purified membranes, it had previously been proposed that the SQR from Gram-positive bacteria supports this reaction at the expense of the protonmotive force, Δp. Nonetheless, it has been argued that the observed Δp dependence is not associated specifically with the activity of SQR because the occurrence of artifacts in experiments with bacterial membranes and whole cells can not be fully excluded. Clearly, definitive insight into the mechanism of catalysis of this intriguing reaction required a corresponding functional characterization of an isolated, membranebound SQR from a Gram-positive bacterium. The first aim of the present work addresses the question if the general feasibility of the energetically uphill electron transfer from succinate to menaquinone is associated specifically to a single enzyme complex, the SQR. The prerequisite to achieve this goal was stable preparation of this enzyme.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
The glycine receptor (GlyR) is the major inhibitory neurotransmitter receptor in spinal cord and brainstem. Heteropentameric GlyRs are clustered and anchored at inhibitory postsynaptic sites by the binding of the large intracellular loop between transmembrane domains 3 and 4 of the GlyRbeta subunit (GlyRbeta-loop) to the cytoplasmic scaffolding protein gephyrin. GlyRs are also cotransported with gephyrin along microtubules in the anterograde and retrograde direction due to the binding of gephyrin to microtubule-associated motor proteins. Additionally, GlyRs undergo lateral diffusion in the plasma membrane from extrasynaptic to synaptic sites and vice versa. Since its discovery, gephyrin has remained for many years the only binding partner interacting directly with the GlyRbeta subunit. In an attempt to elucidate further mechanisms involved in GlyR function and regulation at inhibitory postsynaptic sites, a proteomic screen for putative binding partners to the GlyRbeta loop was performed. Three proteins were identified as putative interactors. In this thesis, the interaction between these putative binding proteins and the GlyRbeta subunit was analyzed and characterized. Binding studies with glutathione-S-transferase fusion proteins revealed that all putative binding proteins, Syndapin (Sdp), Vacuolar Protein Sorting 35 (Vps35) and Neurobeachin (Nbea), interact specifically with the GlyRbeta loop. The Sdp family of proteins are F-BAR and SH3 domain containing proteins. Inmmunocytochemical experiments showed that SdpI as well as the isoforms SdpII-S and SdpIIL colocalize with the full-length GlyRbeta subunit in a mammalian cell expression system. In cultured spinal cord neurons, a partial colocalization of endogenous SdpI with several excitatory and inhibitory synaptic markers was demonstrated. Mapping experiments using deletion mutants narrowed the SdpI binding site down to 22 amino acids. Peptide competition experiments confirmed the specificity of the interaction between SdpI and this sequence of the GlyRbeta subunit. Point mutation analysis revealed a SH3-proline rich domain dependent interaction between SdpI and the GlyRbeta subunit, respectively. In addition, binding studies in mammalian cells showed that both splice variants of SdpII as well as SdpI interact with the GlyR scaffolding protein gephyrin. Although the SdpI and gephyrin binding sites do not overlap, protein competition studies revealed that interaction of the E-domain of gephyrin with the GlyRbeta loop interferes with SdpI binding. Since SdpI is a dynamin binding protein involved in vesicle endocytosis and recycling pathways, a possible function of SdpI in the regulation of GlyR synaptic distribution was investigated. Co-immunoprecipitation experiments confirmed a SdpI-GlyR association in the vesicle-enriched fraction of rat spinal cord tissue. Immunocytochemical studies of SdpI knock out mice showed that the clustering and distribution of GlyRs in the brain stem is unchanged. However, acute down-regulation of SdpI in rat spinal cord neurons by viral shRNA expression led to a reduction in the number and size of GlyR clusters, an effect that could be rescued upon shRNA-resistant SdpI overexpression. Further immunocytochemical analysis of the localization of gephyrin, the gamma2 subunit of the type A gamma-aminobutyric acid receptor (GABAARgamma2 subunit) and the vesicular inhibitory amino acid transporter (VIAAT) under SdpI knock-down conditions showed that both the number and average size of the gamma2-subunit containing GABAA receptor clusters were significantly reduced in spinal cord neurons. In contrast to GlyR and GABAARgamma2 immunoreactivity, the number and average size of gephyrin and VIAAT clusters were barely reduced upon SdpI downregulation. These results suggest that SdpI has a role in GlyR trafficking that can be compensated by other syndapin isoforms or other trafficking pathways. Furthermore, SdpI might be required for the clusters of GlyRs and gamma2-subunit containing GABAARs in spinal cord and brainstem. Vps35 is the core protein of the retromer complex, which mediates the endosome to Golgi apparatus retrieval of different types of receptors in mammals and yeast. Here, protein-protein interaction assays revealed for the first time that Vps35 interacts directly with the GlyRbeta loop as well as with gephyrin. The generation of specific Vps35 antibodies allowed to determine the distribution of this protein in the central nervous system. Immunocytochemical analyses revealed the presence of Vps35 in the somata and neurites of spinal cord neurons, suggesting a possible interaction of Vps35 with the GlyR under physiological conditions. Nbea is a BEACH domain containing, neuron-specific protein. Binding studies revealed a direct interaction between two regions of Nbea and the GlyRbeta loop. Immunocytochemical experiments confirmed a somatic and synaptic distribution of Nbea in primary cultures. In spinal cord neurons, a partial colocalization of Nbea with excitatory and inhibitory synaptic markers suggests a possible interaction of Nbea with the GlyR at inhibitory synaptic sites.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
The various OPE mixtures were also tested on sSOI material which consists of a thin strained silicon layer on top of an insulator like silicon dioxide. The OPE A, B and F are able to reveal threading dislocations (TD) in the strained silicon film (chapter 5.11). The TD densities determined for the OPE A correspond very well with those obtained with the Secco diluted reference. The tested OPE mixtures are not able to delineate other crystal defects like stacking faults, pile ups or twins, which also appear in the strained silicon. Some Organic Peracid Etches were also tested on wafers with an epitaxial silicon layer and on silicon substrates. Epitaxially produced silicon layers are nearly defect-free. Etching times were chosen such that only a part of the epitaxial layer was removed. Nevertheless, after very long etching times (> 16 h) isolated pits were found, with defect densities ranging from 104/cm3 to 106/cm3 depending on the etching solution used. No etch pits were found in the remaining epitaxial layer when OPE F was used. Longer etching times appear to favour the formation of artefects. These artefacts could be caused by the formation of gas bubbles, particles or micro scratches at the crystal surface. The OPE C and D are able to reveal vacancy agglomerates (D-defects) in silicon substrates (see under 5.5, 5.6 and 5.11in chapter 5). Due to their low removal rates and the long etching times which favour the formation of artifacts, these solutions are less suited to the delineation of defects in silicon substrates. In the second part of this study the different etch formulations have been compared with each other in respect of their physical properties like removal rates, activation energies, standard potentials and selectivities (chapter 6). The selectivity was determined at etch pits caused by dislocations. The depth of the etch pits, determined by atomic force microscopy (AFM), should be dependent on the selectivity of the corresponding etching solution used. The higher the selectivity of the solution the deeper the etch pit should be. It was assumed that a low removal rate and a high activation energy for the etching process should correspond to a high selectivity. However, the experimental results have shown that it is not possible to predict the selectivity of an etching solution from experimental parameters like removal rate or activation energy. One must bear in mind that selectivity was only determined on one particular type of crystal defect, namely on dislocations. Values for selectivity in the etching solutions can differ for other defect types. Besides the etching solutions used in this study differ considerably from each other in respect of their chemical and physical roperties. They can be divided into three completely different etching systems. The original Secco solution and the diluted variations thereof are hydrofluoric acid-dichromate mixtures with the Cr6+ species as the oxidizing agent. The Jeita and MEMC solutions contain nitric acid, hydrofluoric acid and, as diluents, acetic acid and water. Here the oxidizing agents are various N(III) species which are formed autocatalytically during the etching process. The concentration of acetic acid also plays an important role as it lowers the degree of dissociation of HF and of HNO3. This has an influence on the pH and the standard potential of the etching solution. The Organic Peracid Etches are mixtures of hydrogen peroxide and a short-chain alkanoic acid like acetic acid. Such systems are strictly speaking not aqueous solutions, the reactive species is the peracid formed.Within each system, however, a certain relationship is perceived between the selectivity of the etching solution on the one hand, and the and the activation energy or the removal rate on the other. The decreased activation energy for the etching process of silicon at a dislocation can be calculated from experimental data by using the Arrhenius equation (chapter 6.3). It was found that the strain inside the crystal lattice caused by a dislocation loop leads to an increase of the potential energy of ~ 5 % and, hence, a decrease of the activation energy of ~ 5 % and an increase in the removal rate of ~ 100 %.
Orthopoxviruses are large DNA viruses that replicate within the cytoplasm of infected cells encoding over a hundred different proteins. The orthopoxviral 68k ankyrin‐like protein (68k‐ank) is highly conserved among orthopoxviruses, and this study aimed at elucidating the function of 68k‐ank. The 68k‐ank protein is composed of four ankyrin repeats (ANK) and an F‐box‐like domain; both motifs are known proteinprotein interaction domains. The F‐box is found in cellular F‐box proteins (FBP), crucial components of cellular E3 ubiquitin (Ub) ligases. With yeast‐two‐hybrid screens and subsequent co‐immunoprecipitation analyses, it was possible to identify S‐phase kinase‐associated protein 1a (Skp1a) as a cellular counterpart of 68k‐ank via binding to the F‐box‐like domain. Additionally, Cullin‐1 was co‐precipitated, suggesting the formation of a viral‐cellular SCF E3 Ub ligase complex. Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) ‐ being attenuated and unable to replicate in most mammalian cell lines due to a block in morphogenesis – nevertheless, expresses its complete genetic information attributing to its properties as promising vector vaccine. Conservation of 68k‐ank as the only ANK protein encoded by MVA implied a substantial role of this viral factor. Hence, its function in the viral life cycle was assessed by studying a 68k‐ank knock‐out MVA. A mutant phenotype manifested in nonpermissive mammalian cells characterized by a block succeeding viral early gene expression and by a reduced ability of the virus to shutoff host protein synthesis. Studies with MVA encoding a 68k‐ank F‐box‐like domain truncated protein revealed that viral‐cellular SCF complex formation and maintenance of viral gene expression are two distinct, unrelated functions fulfilled by 68k‐ank. Moreover, K1, a well‐described VACV host range factor of the ANK protein family, is able to complement 68k‐ank function. This suggests that gene expression of MVA putatively depends on the ANKs encoded in 68k‐ank. In addition to the important findings in vitro, first virulence studies with the mouse pox agent, ectromelia virus (ECTV) deleted of the 68k‐ank ortholog (C11) suggested that this factor contributes to ECTV virulence in vivo.
In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
1. Fab co-complexes of proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) Fab fragments suitable for co-crystallization with complex I were generated using an immobilized papainbased protocol. The binding of the antibody fragments to complex I was verified using Surface Plasmon Resonance and size exclusion chromatography. The binding constants of the antibodies and their respective Fab fragments were found to be in the nanomolar range. This work presents the first report on successful crystallization of complex I (proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica with proteolytic Fab fragments. The quality of the crystals was significantly improved when compared to the initial experiments and the best crystals diffracted X-rays to a resolution of ~7 Å. The activity of complex I remained uninfluenced by antibody fragment binding. The initial diffraction data suggest that the complex I/Fab co-complex crystals represent a space group different to the one observed for the native protein. Ongoing experiments are aimed at further enhancements of the diffraction quality of the crystals. Providing a different space group the CI/Fab co-complexes may become a very useful approach for structure determination of the enzyme. Moreover, the bound Fab offers an additional possibility to generate phase information. The antibody-mediated crystallization represents a valuable tool in structural characterization of the NADH:oxidoreductase subcomplexes or even single subunits. 2. UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase from Yarrowia lipolytica displays affinity towards Ni2+ NTA and was first detected in a contaminated sample of complex I. Following, separation from complex I, Ugp1p was purified using anion exchange chromatography. Sequence similarity studies revealed high identity to other known pyrophosphorylases. As indicated by laser-based mass spectrometry method (LILBID) Ugp1p from Y. lipolytica builds octamers similarly to the enzyme from Saccharomyces cerevisiae. The initial crystals grew as thin needles favorably in sitting drop setups. The size of the crystals was increased by employment of a micro batch technique. The improved crystals diffracted X-rays to a resolution of 3.2 Å at the synchrotron beamline. Structural characterization is under way using a molecular replacement approach based on the published structure of baker’s yeast UGPase.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Leukotrienes constitute a group of bioactive lipids generated by the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway. An increasing body of evidence supports an acute role for 5-LO products already during the earliest stages of pancreatic, prostate, and colorectal carcinogenesis. Several pieces of experimental data form the basis for this hypothesis and suggest a correlation between 5-LO expression and tumor cell viability. First, several independent studies documented an overexpression of 5-LO in primary tumor cells as well as in established cancer cell lines. Second, addition of 5-LO products to cultured tumor cells also led to increased cell proliferation and activation of anti-apoptotic signaling pathways. 5-LO antisense technology approaches demonstrated impaired tumor cell growth due to reduction of 5-LO expression. Lastly, pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumor cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway. However, the documented strong cytotoxic off-target effects of 5-LO inhibitors, in combination with the relatively high concentrations of 5-LO products needed to achieve mitogenic effects in cell culture assays, raise concern over the assignment of the cause, and question the relationship between 5-LO products and tumorigenesis. Keywords: leukotriene, apoptosis, cell proliferation, mitogenic effects, cytotoxicity
Es wurden mit phys. Verfahren hergestellte 200 und 500 nm dicke Niobfilme auf oxidiertem Si thermischen Kurzzeitprozessen (RTP) unterzogen, um Oxynitride zu synthetisieren. Die Filme wurden mit verschiedenen Methoden untersucht, um einen Überblick über die entstandenen Produkte und ihre Position im Film zu erlangen. Die Reaktionen wurden in N2 oder NH3 zur Nitridierung mit anschließender Oxidation in O2 durchgeführt. Um eine mögliche direkte Einstufensynthese von Oxynitriden des Niobs zu finden, wurde N2O eingesetzt. Der einfachste Ansatz zur Präparation von Oxynitriden bestand in der Verwendung des N2 und NH3, mit denen die Metallfilme zwischen 600 und 1200 °C umgesetzt wurden. Die Nitridierung mit N2 verlief von der Bildung einer festen Stickstofflösung in Niob bei tiefen Temperaturen über Nb2N zwischen 700 und 1000 °C bis zum Nb4N3 oberhalb 1000 °C. Aus dem Substrat diffundierte Sauerstoff aus, der am Interface Nb/SiO2 zur Bildung einer Oxidzone führte. Der O-Gehalt der Oxide stieg mit steigender Reaktionstemp. Unterhalb 1000 °C wurde NbO gefunden, oberhalb 1000 °C bildete sich NbO2. Eine TEM-Untersuchung gekoppelt mit EEL-Spektrometrie ergab Hinweise auf die Bildung einzelner stickstoffreicher NbOxNy-Kristallite im Bulk der mit N2 umgesetzten Filme. Auch die Nitridierung mit NH3 ergab eine Abhängigkeit des N-Gehaltes der Produkte von der Rkt.-Temperatur. Es erfolgte die Bildung der festen Lösung und Nb2N bei tiefen und mittleren Temperaturen. Ab 900 °C bildete sich NbN, oberhalb 1100 °C wurde vermutlich Nb4N5 detektiert. Im Gegensatz zur Umsetzung mit N2 ergaben genauere Untersuchungen der in NH3 nitridierten Filme keine Hinweise auf die Bildung von Oxynitriden. Die Erstellung von Tiefenprofilen zeigte, dass sich Nitridphasen mit höchstem N-Gehalt an der Oberfläche befanden und der Anteil des Stickstoffs in den Produkten mit zunehmender Tiefe abnahm. Mit Oxiden verhielt es sich umgekehrt: Sobald höhere Oxide gebildet wurden, befanden sie sich am Interface, wo die Sauerstoffkonzentration am höchsten ist. Oxide mit niedrigerem O-Gehalt wurden in der Filmmitte gefunden, wo der Sauerstoff durch die gebildeten Nitride an der Diffusion in Richtung Filmoberfläche gehindert wurde. Die 200-nm-Filme waren formal reaktiver als die 500-nm-Filme. Sie bildeten bereits bei tieferen Temperaturen Phasen mit höherem N- oder O-Gehalt, wofür das geringere zur Verfügung stehende Volumen ursächlich ist. Die Reinheit der Filme führte zu Unterschieden in der Reaktivität: Gesputterte Filme waren reiner als aufgedampfte Filme, die auf Grund der Einlagerung einer geringen Sauerstoffmenge während der Präparation passiviert waren. Dadurch wurde die Diffusion des Stickstoffs eingeschränkt zur Bildung abweichender Phasen zwischen aufgedampften und gesputterten Filmen. Eine Variante der Nitridierung in N2 bzw. NH3 bestand in der Verwendung von O2 als Kühlgas. Die Zugabe des O2 wurde bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Statt der Einlagerung von Sauerstoff in das Oberflächennitrid unter Oxynitridbildung kam es zur Bildung einer oxidischen Deckschicht. Die Bildung der Schicht erforderte eine Zugabetemperatur höher als 700 °C, bei tieferen Temperaturen war der Film durch das bereits gebildete Nitrid soweit passiviert, dass keine chemische Veränderung stattfand. Die im Nitridierungsschritt gebildeten Produkte wurden als Auswirkung des sog. Schneepflugeffektes unter Kompression in tiefere Filmregionen verschoben. Dies führte zur Bildung von Produkten höherer Stöchiometrie (Nb2N zu NbN oder NbO zu NbO2). Der Einsatz von Lachgas, der zur Einlagerung von N2O-Einheiten in den Metallfilm führen sollte, verlief ergebnislos. Bei Prozesstemperaturen unterhalb 450 °C wurde lediglich die Bildung einer festen Lösung von Sauerstoff im Niob nachgewiesen. Oberhalb 450 °C zersetzte sich N2O unter O-Bildung wodurch der Film oxidiert wurde. Die Umsetzung nitridierter Filme mit N2O und auch dessen Verwendung als Kühlgas brachte keine Veränderung. Die Oberflächennitride waren stabil gegenüber dem N2O. Die Nitridierung der Filme im N2-Strom wurde durch die stoßweise Zugabe von O2 bzw. N2O nach definierten Zeiten variiert. Die Filme bilden nach kurzen Nitridierungszeiten von maximal 20 s gefolgt von einem 10-sek. Sauerstoffstoß eine komplizierte Filmstruktur aus, wie das elementare Tiefenprofil zeigt, das in denselben Filmzonen sowohl Stickstoff als auch Sauerstoff nachweist. Da die Röntgendaten lediglich die Bildung von NbO2 nachweisen, jedoch mit einer leichten Verschiebung der Reflexe zu kleineren Winkeln aufgrund der Einlagerung der größeren Nitridionen in das Oxidgitter, muss es sich bei dem präparierten Film um ein Oxynitrid der Form NbO(2-x)Nx handeln, in dem das Verhältnis von N zu O auf der sauerstoffreichen Seite liegt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.
Type 1 diabetes (T1D) is a chronic T cell-mediated autoimmune disorder that results in the destruction of insulin-producing pancreatic ß cells leading to life-long dependence on exogenous insulin. Attraction, activation and transmigration of inflammatory cells to the site of ß-cell injury depend on two major molecular interactions. First, interactions between chemokines and their receptors expressed on leukocytes result in the recruitment of circulating inflammatory cells to the site of injury. In this context, it has been demonstrated in various studies that the interaction of the chemokine CXCL10 with its receptor CXCR3 expressed on circulating cells plays a key role in the development of T1D. Second, once arrived at the site of inflammation adhesion molecules promote the extravasation of arrested cells through the endothelial cell layer to penetrate the site of injury. Here, the junctional adhesion molecule (JAM) JAM-C expressed on endothelial cells is involved in the process of leukocyte diabedesis. It was recently demonstrated that blocking of JAM-C efficiently attenuated cerulein-induced pancreatitis in mice. In my thesis I studied the influence of the CXCL10/CXCR3 interaction on the one hand, and of the adhesion molecule JAM-C on the other hand, on trafficking and transmigration of antigen-specific, autoaggressive T cells in the RIP-LCMV mouse model. RIP-LCMV mice express the glycoprotein (GP) or the nucleoprotein (NP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a target autoantigen specifically in the ß cells of the islets of Langerhans and turn diabetic after LCMV-infection. In my first project I found that pharmacologic blockade of CXCR3 during development of virus-induced T1D results in a significant delay but not in an abrogation of overt disease. However, neither the frequency nor the migratory properties of islet-specific T cells was significantly changed during CXCR3 blockade. In the second project I was able to demonstrate that JAM-C was upregulated around the islets in RIP-LCMV mice after LCMV infection and its expression correlated with islet infiltration and functional ß-cell impairment. Blockade with a neutralizing anti-JAM-C antibody slightly reduced T1D incidence, whereas overexpression of JAM-C on endothelial cells did not accelerate virus-induced diabetes. In summary, our data suggest that both CXCR3 as well as JAM-C are involved in trafficking and transmigration of antigen-specific autoaggressive T cells to the islets of Langerhans. However, the detection of only a moderate influence on the onset of clinical disease during CXCR3 or JAM-C blockade reflects the complex pathogenesis of T1D and indicates that several different inflammatory factors need to be neutralized in order to achieve a stable and persistent protection from disease.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Durchgeführte Arbeiten und Ergebnisse: Zur Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen im Chemieunterricht wurde zunächst eine grundlegende fachliche Recherche durchgeführt, um mögliche thematische Schwerpunkte zu identifizieren und Grundlagen für eine experimentelle Zugänglichkeit zu erarbeiten. Parallel hierzu wurde der derzeitige Stand der fachdidaktischen Forschung unter besonderer Berücksichtigung des Themas Lebensmittelverpackungen erhoben. Es zeigte sich, dass nur vereinzelt auf diese Themenstellung eingegangen wird. Dabei steht allerdings, wie etwa bei dem Recycling von Joghurtbechern, die stoffliche Weiterverwendung von Abfällen im Vordergrund, während die Anforderungen an die Eigenschaften einer Verpackung keine Rolle spielen. Daher erfahren Bau und Funktion unterschiedlicher Verpackungsmaterialien in der vorliegenden Arbeit eine besondere Berücksichtigung. Die vorliegende Arbeit umfasst im Wesentlichen zwei Schwerpunkte: - Die schulexperimentelle Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen für unterschiedliche Klassenstufen, - die exemplarische Ausarbeitung von Unterrichtseinheiten, die die Möglichkeit der Integration der Experimente in die Schulpraxis aufzeigen. Bei der experimentellen Entwicklung stand die Barrierefunktion der Lebensmittelverpackungen und im Hinblick auf die Verträglichkeit mit Lebensmitteln deren chemische Zusammensetzung im Vordergrund. Gesichtspunkte wie die mechanische Belastbarkeit, z. B. die Reißfestigkeit einer Verpackungsfolie, wurden erst in zweiter Linie erarbeitet. Die Struktur-Eigenschaftsbeziehungen wurden thematisiert. Zunächst wurde eine Versuchsreihe ausgearbeitet, die die Funktion von Aluminiumschichten in Lebensmittelverpackungen in das Zentrum der Betrachtung stellt. Hierbei konnte zur Bestimmung der Dicke einer Aluminiumschicht mit schulischen Mitteln ein Verfahren ausgearbeitet werden, in dem die Aluminiumanteile einer ausgemessenen Fläche einer Verpackung gelöst und anschließend über eine Titration bestimmt werden. Diese Versuchsreihe kann auf viele Beispiele angewandt werden und liefert zuverlässige Ergebnisse. Der Nachweis unterschiedlicher Kunststoffe in Lebensmittelverpackungen stand im Mittelpunkt einer zweiten Versuchsserie. Hierbei wurden Versuche zur Analyse von Verpackungsstoffen (Polyolefine und Polykondensate) entwickelt und zusammengestellt. Einfache Versuche zeigen die Möglichkeit zur Trennung der Schichten von Verbundfolien sowie die chemische Beschaffenheit der verwendeten Polymere. Es wird anhand der gewählten Beispiele auf die unterschiedlichen Eigenschaften von Folien, wie Sauerstoffdurchlässigkeit und Wasserdampflöslichkeit, eingegangen. Dabei wird die gezielte Kombination unterschiedlicher Folien berücksichtigt. Eine wesentliche Fragestellung bei der Auswahl von Lebensmittelverpackungen ist die Frage nach der Barrierewirkung gegenüber unerwünschten Stoffen, z.B. von Sauerstoff. Hierbei gelang es, eine Zink-Luft-Batterie so in eine geeignete Schaltung einzubauen, dass sie zum Nachweis des Sauerstoffdurchtritts durch eine Folie verwendet werden kann. Allerdings ist dieser bei üblicherweise verwendeten Folien so gering, dass im Sinne einer didaktischen Reduktion für einen Modellversuch Backpapier eingesetzt wird, um ein Experiment zu erhalten, das in einer Schulstunde durchgeführt werden kann. Eine weitere umfangreiche Versuchsserie wurde zur Durchlässigkeit von PET-Flaschen gegenüber Kohlenstoffdioxid entwickelt. Besonders interessant für Schülerinnen und Schüler sind dabei Experimente, die zeigen, dass PET Kohlenstoffdioxid in geringen Mengen speichert. Exemplarische Unterrichtsentwürfe zeigen, welche konkreten Möglichkeiten für die Umsetzung des Themas gegeben sind. Hierfür wurden exemplarisch Entwürfe zum Forschend-entwickelnden Unterrichtsverfahren, zum Analytisch-synthetischen Verfahren, zum Expertenunterricht, zur Chemie im Kontext, zum Wahldifferenzierten Chemieunterricht und zum Projektunterricht / projektorientierten Chemieunterricht ausgearbeitet. Insgesamt vermittelt die vorliegende Arbeit einen umfassenden Zugang zum Thema Lebensmittelverpackung im Chemieunterricht, wobei ausgehend von den fachlichen Grundlagen die schulexperimentellen Möglichkeiten und Wege der unterrichtlichen Umsetzung entwickelt wurden.
Die Sonne strahlt weltweit pro Tag genügend Licht ein, um den Weltenergiebedarf für ein ganzes Jahr abzudecken. Somit ist sie die Quelle aller erneuerbarer Energien, denn neben der Erzeugung von Elektrizität aus Licht (Photovoltaik) regelt sie die Gezeiten und damit auch Wind und Wellen, die bei der Windkraft und in Gezeitenkraftwerken genutzt werden. Außerdem liefert sie die Energie für die Photosynthese in nachwachsenden Rohstoffen. Es gibt diesbezüglich nur ein grundlegendes Problem: Erneuerbare Energien fi nden wir in ausreichender Menge vor allem an Stellen mit mangelnder Infrastruktur. Sonnenenergie gibt es am meisten in der Wüste, Wind auf dem Meer und Biomasse im Dschungel. An Orten hoher Industrialisierung und damit auch hoher Bevölkerungsdichte ist für die »Erneuerbaren « so gut wie kein Platz. Es gibt demnach kein Energieproblem, aber ein Problem der Energiespeicherung und des Energietransportes.
Synthese und Optimierung von Nitroxyl-Spin-Labeln zur Analyse von Nukleinsäuren mittels EPR und NMR
(2010)
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Einsatz der Nitroxyl-Spin-Markierung für die Strukturaufklärung von Oligonukleotiden getestet. Dafür wurden im Vorfeld verschiedene Spin-Label synthetisiert und charakterisiert. Bei den Nitroxiden handelt es sich hierbei um das Spin-Label TPA (2,2,5,5-Tetramethyl-pyrrolin-1-oxyl-3-acetylene) und TEMPA (2,2,6,6-Tetramethyl-3,4-dehydro-piperidin-N-oxyl-4-acetylene). Beide Spin-Label wurden auch als deuteriert und 15N-markiert synthetisiert. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen auf dem Gebiet der Modell-Systeme und Modell-RNAs wurden biologisch relevante und strukturell anspruchsvolle Oligonukleinsäuren untersucht. Dabei konnten DNA-RNA-Hybride, die HCV-IRES Domain II, ein Tetra-Loop, das Neomycin-B Aptamer, das Diels-Alder Ribozym und ein Nep1-RNA-Komplex charakterisiert werden. Die Einführung des Spin-Labels erfolgte noch auf der Festphase mittels der Sonogashira-Kreuz-Kupplungs Reaktion.