Biochemie und Chemie
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Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Alkylating NAD-Analogs, Glyceraldehyde-3 Phosphate Dehydrogenase, Half-of-the-Sites Reactivity co-(3-Bromoacetylpyridinio)alkyldiphosphoadenosines with alkyl chain lengths of 2 -6 me thylene groups inactivate glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase from rabbit muscle. Half-of-the-Sites reactivity is observed in each case: The analogs are covalently bound to highly reactive cysteine residues in two of the four subunits. The remaining two subunits still bind N AD and the reactive SH-groups, although modified by SH-reagents of low molecular weight are not labeled by any of the brominated coenzyme models. This behaviour may be explained by the assumption, that the modification of 2 subunits induces structural changes in the neighboured unoccupied subunits which prevent any attack on reactive cysteine residues caused by fixation and orientation of the bromoketo-coenzyme analog when bound to the active center. Structural similarities of the covalently bound coenzyme analogs in the active center and the native ternary GAPDH-NAD-substrate complex suggest that half-of-the-sites reactivity is a natural characteristic of the enzymes catalytic mechanism.
Chemiker stehen in ihrer Mentalität Architekten nahe: Sie planen und bauen Moleküle. Schon lange, bevor der atomare Aufbau der Materie experimentell bewiesen war, entwickelten sie genaue Vorstellungen über die Raumstruktur von Molekülen. Erst zu Beginn des 20.Jahrhunderts wurden diese "Arbeitshypothesen" – zum Beispiel das von Jacobus van’t Hoff postulierte Tetraedermodell für den vierbindigen Kohlenstoff – von den Physikern glänzend bestätigt. Zwar ist es mittlerweile möglich, die Struktur von unbekannten Molekülen zuverlässig vorherzusagen; doch nach wie vor sind genaue experimentelle Strukturbestimmungen ein unverzichtbarer Bestandteil vieler Forschungsprojekte.
Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
In the title compound, C12H14N22+·2Cl-, the 4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridinium cation is essentially planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.004 Å) and is located on a crystallographic inversion centre. The cations and chloride anions lie in planes parallel to (111) and are connected by N-H...Cl and C-H...Cl hydrogen bonds. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 173 K; mean σ(C–C) = 0.003 Å; R factor = 0.036; wR factor = 0.080; data-to-parameter ratio = 14.7.
Die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichtes in einem mehrzelligen Organismus erfordert Mechanismen, welche die Balance zwischen der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen und der Auslösung einer Immunantwort ermöglichen. Diese Mechanismen werden unter dem Begriff periphere Toleranz zusammengefasst. Regulatorische T-Zellen (Treg) sind eine T-Zell-Subpopulation, die für periphere Toleranz und Homöostase des Immunsystems von großer Bedeutung sind (Powrie et al., 2003). Durch ihre suppressiven Eigenschaften sind Treg in der Lage, die Proliferation von konventionellen T-Zellen (Tcon) sowohl in vivo als auch in vitro zu hemmen und so eine Immunantwort von autoreaktiven TZellen einzudämmen. Für die Hemmung von Tcon in vitro wird der direkte Zellkontakt zwischen Treg und Tcon benötigt (Thornton und Shevach, 1998). Der molekulare Mechanismus humaner Treg ist bislang jedoch nur unzureichend geklärt. In der hier vorgestellten Forschungsarbeit wurden TZR-abhängige Signaltransduktionskaskaden analysiert, um den molekularen Mechanismus humaner Treg sowohl auf Ebene der Treg als auch auf Ebene der gehemmten Tcon zu entschlüsseln. Hierzu wurden im Rahmen der hier beschriebenen Experimente in unserer Abteilung die ex vivo Isolation und die in vitro Expansion humaner Treg etabliert. Mit Hilfe sensitiver Analysemethoden der TZR-abhängigen Signaltransduktionskaskaden konnte für humane Treg gezeigt werden, dass sie nach Stimulation über ihren TZR einen geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zu dem in Tcon aufweisen. Ein weiteres Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit ist, dass Treg im Zuge ihrer Aktivierung eine geringere Phosphorylierung einiger, für die TZR-induzierte-Signalkaskade relevante Signalmoleküle wie ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Für gehemmte Tcon aus der Kokultur mit humanen Treg wurde in dieser Forschungsarbeit ein zu Kontroll-Tcon vergleichbarer Ca2+-Einstrom detektiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen außerdem, dass Tcon aus der Kokultur mit Treg eine verringerte Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Die hier veröffentlichten Ergebnisse ermöglichen einen ersten Einblick in die molekulare Signaltransduktion von humanen Treg und zum ersten Mal auch in die von gehemmten Tcon. Dieses Verständnis stellt eine Grundlage für weitere Experimente dar und ermöglicht einen Schritt in Richtung der vollständigen Entschlüsselung des molekularen Mechanismus humaner Treg, die eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz dieser Zellen ist. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Immunantwort zu untersuchen. Für die Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen ist die effiziente und immunologisch unauffällige Eliminierung apoptotischer Zellen unabdingbar (Fadok et al., 1998; Lauber et al., 2004; Skoberne et al., 2005; Steinman und Nussenzweig, 2002). Im Rahmen der hier erläuterten Experimente wurden in vitro Studien durchgeführt, die einen inhibierenden Effekt apoptotischer Zellen auf die Reifung humaner dendritischer Zellen zeigen. Es konnte bestätigt werden, dass dendritische Zellen nach Phagozytose apoptotischer Zellen weniger proinflammatorische Moleküle sekretieren und eine geringere Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle aufweisen. Nach Etablierung zweier in vitro Modellsysteme wurde in weiteren Experimenten gezeigt, dass T-Zellen durch dendritische Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben, eine geringere Stimulation erfahren. Diese Ergebnisse deuten auf einen anti-stimulatorischen Effekt dendritischer Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben hin, und sie bilden die Basis für eine anschließende in vitro Analyse der molekularen Auswirkungen auf dendritische Zellen und T-Zellen.
Host cell invasion by the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes requires the invasion protein InlB in many cell types. InlB consists of an N-terminal internalin domain that binds the host cell receptor tyrosine kinase Met and C-terminal GW domains that bind to glycosaminoglycans (GAGs). Met binding and activation is required for host cell invasion, while the interaction between GW domains and GAGs enhances this effect. Soluble InlB elicits the same cellular phenotypes as the natural Met ligand hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), e.g. cell scatter. So far, little is known about the central part of InlB, the B-repeat. Here we present a structural and functional characterization of the InlB B-repeat. The crystal structure reveals a variation of the β-grasp fold that is most similar to small ubiquitin-like modifiers (SUMOs). However, structural similarity also suggests a potential evolutionary relation to bacterial mucin-binding proteins. The B-repeat defines the prototype structure of a hitherto uncharacterized domain present in over a thousand bacterial proteins. Generally, this domain probably acts as a spacer or a receptor-binding domain in extracellular multi-domain proteins. In cellular assays the B-repeat acts synergistically with the internalin domain conferring to it the ability to stimulate cell motility. Thus, the B-repeat probably binds a further host cell receptor and thereby enhances signaling downstream of Met.
The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells.
This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery.
For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library.
The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen.
The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
"Ästhetisch ist, was hilft"
(2017)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Regiospezifität und Spaltungsausbeute von 5’-modifizierten Trisbenzimidazolkonjugaten wie 53 unter Verwendung von Helfer-Sequenzen verbessert werden (S.74 ff). Mit dieser Technik gelang es, Turnover zu erzielen und so eine echte katalytische Aktivität der DNA-Konjugate nachzuweisen. Die verwendeten Helfer-DNA-Sequenzen sind günstig zu erwerben oder mit einem DNA-Synthesizer leicht selbst herzustellen und können so der jeweiligen Aufgabe perfekt angepasst werden.
Weiterhin wurden verschiedene Versuche unternommen, ein 5’-modifiziertes Konjugat maßzuschneidern, so dass es durch interne bulge-Bildung mit seinem Substrat ebenfalls Turnover erreichen könnte und so katalytische Aktivität zeigte (S.59 ff). Diese Projekte wurden in Anlehnung an Arbeiten von Häner [91] durchgeführt, der damit Turnover erzielte, da das Konjugat nach Spaltung des bulges wieder in den katalytischen Zyklus eingegliedert werden konnte. Leider waren diese Versuche nicht von Erfolg gekrönt, obwohl man sich bei der Konzipierung der Substrat-Konjugat-Hybriden an die Sequenzen von Häner et.al. hielt. Statt dessen beobachtete man im Falle von Konjugat 51 bei der Hybridisierung die Ausbildung einer Helix; ein bulge konnte nicht erhalten werden (S. 61). Dieser Unterschied könnte auf die große, planare Spaltereinheit mit Europium(III) von Häner et. al. zurück zu führen sein, die im Falle der von uns untersuchten Konjugat-Substrat-Hybride fehlte, denn die 2-Aminobenzimidazol-Einheiten von Trisbenzimidazol 15 waren im Vergleich als klein anzusehen.
Diese Vermutung führte schließlich zu zwei unterschiedlichen Ansätzen. Einer davon war es, eine größere intercalationsfähige Teilstruktur in das Konjugat einzuführen. Man versuchte deshalb ein Konjugat zu synthetisieren, welches zwischen der katalytischen Einheit und dem sequenzerkennenden Teil die Pyrenaminosäure 56 von Dr. M. Suhartono trug (S. 69 ff).
Dieses sollte den großen, Häner’schen Rest imitieren und so einen bulge erzeugen. Leider gelang die Synthese dieses Konjugates nicht. Wie sich heraus stellte, war das kommerziell erworbene DNA-Material nicht geeignet für die angewendete Synthese. Eine Basen-Schutzgruppe bzw. das Anhydrid derselben, welches bei der Festphasensynthese als Capping-Reagenz verwendet wurde, führte zu einer irreversiblen Reaktion mit der 5'-NH2-Funktion an der DNA und machten das Material daher für eine Kupplung unbrauchbar.
Eine andere Herangehensweise war es, die Faltung des Konjugat-Substrat-Hybrides voraus zu berechnen und so ein Hybrid zu erhalten, welches einen bulge ausbildete (S. 65 ff). Konjugat 55 und Substrat 54 wurden nach dieser Strukturvorhersage synthetisiert bzw. erworben und entsprachen genau den Erwartungen, ein interner bulge wurde ausgebildet. Dennoch konnte man auch mit diesem System keinen Turnover erreichen.
Ein weiteres großes Teilgebiet dieser Arbeit war die Untersuchung kleiner Moleküle als unspezifische RNA-Spalter. Im Rahmen dieser Arbeit wurden speziell Guanidiniumanaloga auf ihre RNA-Spaltungsfähigkeit untersucht. In der Vergangenheit hatte man als Gütekriterium dieser Verbindungen das Augenmerk auf ihre pKa-Werte gerichtet. Sofern sich diese annähernd im physiologischen Bereich befanden, konnten häufig gute bis sehr gute RNA-Spaltungsausbeuten erzielt werden.
Erstmals kam das Konzept der Energiedifferenz zwischen den tautomeren Formen eines guanidiniumtragenden Moleküls als Werkzeug zur Vorhersage der Güte eines RNA-Spalters zum Einsatz (S.113 ff). Sofern die beiden Strukturen (Amino- und Iminotautomer) sehr geringe Energieunterschiede aufwiesen, sollten sie sich besser als „Protonen-Shuttle“ eignen und so die Phosphosäuretransesterifikation katalytisch besser unterstützen. Zusammen mit dem pKa-Wert der Verbindungen wurde untersucht, ob dieses Konzept als Vorhersagemethode tragfähig ist.
Unter den mit diesen Methoden gefundenen sowie kommerziell erhältlichen Molekülen konnte 2-Aminoperimidin 67 als sehr guter Spalter identifiziert werden. Verglichen mit Trisbenzimidazol 15 erreichte es ebenso gute Spaltungsraten wie letzteres, wobei 67 nur über eine einzige Guanidiniumeinheit verfügt. Dieser so identifizierte neue Kandidat für den Einbau in DNA-Konjugate enttäuschte auch nach Untersuchungen seines N-Methyl-Aminoderivates 80 nicht: Das Derivat zeigte eine ausreichend hohe Spaltungsaktivität, um es in Zukunft als Baustein für antisense-Konjugate in Frage kommen zu lassen.
Es gab allerdings auch Schwierigkeiten bei der Untersuchung der kleinen Moleküle. Problematisch gestaltete sich ihre Löslichkeit in hohen Konzentrationen. Man ging deshalb dazu über, Co-Solventien wie Methanol oder DMSO zu verwenden, um auch während des Experimentes eine ausreichende Löslichkeit der Verbindungen zu gewährleisten. Ein Volumenanteil von 20% Co-Solvens stellte sich als ideal heraus, das Experiment wurde dadurch nicht negativ beeinflusst.
Außerdem kam es zu Präzipitation einiger Substanzen (u.a. 2-Aminoperimidin 67) beim Auftragen auf das Sequenzierergel, welche die Auswertbarkeit dieser Experimente einschränkte. Die Verwendung eines neuen Harnstoffladepuffers beim Auftragen der Proben auf das Gel und das Senken der Substanzkonzentration (von mM auf μM) im Experiment verbesserten diese Situation deutlich. Häufig beobachtete Präzipitationseffekte waren danach größtenteils verschwunden, was die Auswertung der Spaltungsexperimente mit kleinen Molekülen erleichterte (S. 129 ff). Einige Verbindungen konnten mit der Kombination von ΔHf-Wertbestimmung und pKa-Wert-Bestimmung als schlechte RNA-Spalter korrekt vorhergesagt werden (z.B. 2-Aminopyridin 69, 2- Aminopyrimidin 68).
Nicht ganz klar ist das mittelmäßige Abschneiden von Imidazoimidazol 71 als RNA-Spalter (S.136 ff). Durch seine Symmetrie liegt sein ΔHf-Wert bei 0 und auch sein pKa-Wert liegt mit 7.4 perfekt im physiologischen Bereich. Dennoch konnte es nur Spaltungsausbeuten von unter 10% bei Konzentrationen im höheren mM-Bereich erreichen. Es ist aber auch die einzige untersuchte Verbindung, die signifikant RNA schneidet, ohne diese gleichzeitig zu aggregieren oder zu denaturieren.
Untersuchungen des Aggregationsverhaltens der kleinen Moleküle mittels FCS-Messungen (S. 139 ff) zeigten, dass fast alle bei hohen Konzentrationen – etwa im mM- oder hohem μMBereich – Aggregate bilden, und das auch bei Verwendung von Co-Solventien, wie es im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Man kann also bei den kleinen Katalysatoren nicht davon ausgehen, dass isolierte Moleküle für die beobachteten Effekte verantwortlich sind. Vielmehr agieren diese Moleküle bei solchen Konzentrationen als große oder kleine Aggregate, die durch die Vielzahl ihrer katalytischen Einheiten an der Oberfläche ihr Potential vervielfachen. Erst bei niedrigen Konzentrationen lösen sich die Aggregate auf, man kann hier wieder von einem Ein-Molekül-ein-Substrat-Mechanismus ausgehen (s. Schema 3 S. 110).
Dies wird allerdings nicht als Ausschlusskriterium gesehen, diese Moleküle auch weiterhin als potentielle Kandidaten für antisense-Konjugatbausteine zu betrachten. In Konjugaten verhalten sie sich wie Einzelmoleküle, bei denen man streng mechanistische Betrachtungen anstellen kann und darf.
Almost two decades ago, microRNAs were discovered as novel posttranscriptional regulators of gene expression. Since then, research efforts have uncovered their involvement in the control of various cellular processes including migration, proliferation and cell survival. Even more complex events, such as the formation of new blood vessels or organ development, have been shown to be tightly regulated and orchestrated by microRNAs. Due to their crucial regulatory role in tissue homeostasis in vertebrates, it does not come as a big surprise that dysregulated microRNA ex-pression is associated with pathology of diverse diseases. In this regard, the miR-17-92 cluster is a prime example since it has become famous for its amplified expression in tumours and its on-cogenic potential. Our lab demonstrated the expression of the members of the miR-17-92 cluster, namely miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b and -92a, in endothelial cells and provided evidence for the anti-angiogenic activity of miR-92a in ECs as well as its important regulatory role in tissue re-covery after ischemia. In this work we addressed the function of the remaining members of the miR-17-92 cluster, i.e. miR-17, miR-18a, miR-19a and miR-20a, in endothelial cells and angiogenesis. Surprisingly, the individual members all displayed anti-angiogenic properties in endothelial cells in vitro, although overexpression of the whole cluster in transformed colonocytes was shown to promote tumour angiogenesis in a mouse model. In this context, we provide evidence that the individual miRs differentially affect the paracrine angiogenic activity of endothelial and tumour cells. Moreover, Antagomir-mediated inhibition of miR-17/20 in a mouse tumour model did not affect tumour angi-ogenesis, although miR-17/20 inhibition profoundly increased vascularization of Matrigel plugs. Thus, our research efforts suggest a differential involvement of the members of the miR-17-92 cluster in physiological and tumour angiogenesis. Additionally, we identified Janus kinase (JAK) 1 as a novel miR-17 target in endothelial cells and demonstrated the involvement of JAK1 in angio-genesis and in the phosphorylation of STAT3 in response to different cytokines in vitro. Overall, inhibition of specific members of the miR-17-92 cluster might represent an attractive therapeutic strategy to enhance angiogenesis in ischemic diseases. In the second part of the present work we investigated the therapeutic value of Antagomir-mediated microRNA inhibition in animal models of pulmonary arterial hypertension. Collectively, inhibition of miR-17 by the respective Antagomir revealed a significant improvement of pulmonary hemodynamics and cardiac function in both the chronic hypoxia mouse model and the mono-crotaline-induced lung injury rat model. Histomorphometric analysis of the lungs of the pulmonary hypertensive mice and rats uncovered a significant reduction of disease associated musculariza-tion of pulmonary arteries in Antagomir-17 treated animals compared to the control animals indicating interference with smooth muscle cell proliferation or survival. Probing of lung tissue of the pulmonary hypertensive rats for selected miR-17 targets uncovered a profound increase in the expression of the cyclin dependent kinase inhibitor p21 in the Antagomir-17 treated rats suggest-ing that inhibition of miR-17 impairs proliferation by impeding cell cycle progression. Analysis of miR-17 function in human smooth muscle cells in vitro corroborated the results from the animal experiments by demonstrating pro-proliferative activity of miR-17 and decreased levels of p21 in these cells. Collectively, our results indicate that Antagomir-17 improves pulmonary hemodyna-mics and cardiac function by interfering with vascular remodelling within the lung. Hence, inhibi-tion of miR-17 might be of therapeutic value to ameliorate the disease pattern in pulmonary arte-rial hypertension. In summary, the present work provides insights into the regulatory functions of members of the miR-17-92 cluster, especially miR-17, in blood vessels and suggests that specific inhibition of members of the miR-17-92 cluster might be a novel option to treat vascular diseases.
Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.