Biochemie und Chemie
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An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
Es ist bekannt, dass die Aktivierung von S1P-Rezeptoren die Expression von profibrotischen Mediatoren, wie dem Bindegewebswachstumsfaktor CTGF, induzieren und deshalb auch eine Rolle bei der Entstehung der Nierenfibrose spielen kann. In diesem Kontext konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass die Aktivierung von S1P5 zur TGF-β2-induzierten CTGF-Expression in humanen glomerulären Mesangiumzellen beiträgt (Wünsche et al. 2015). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde deshalb die Rolle von S1P5 in einem in vivo-Modell zur Nierenfibrose untersucht. Männliche S1P5-/--Mäuse und Wildtypmäuse mit C57BL/6J-Hintergrund wurden mit einer adeninreichen Diät für jeweils 7 und 14 Tage gefüttert, um eine tubulointerstitielle Fibrose hervorzurufen. Die Nieren von unbehandelten Mäusen des jeweiligen Genotyps dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass S1P5-/--Mäuse geringere Kreatininplasmaspiegel und weniger Schäden im Nierengewebe gegenüber Wildtypen zeigten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die mRNA-Expression von mehreren Fibrosemarkern und proinflammatorischen Zytokinen in den S1P5-/--Mäusen schwächer war als in den Wildtypen. Die Auswertung von histochemischen Färbungen und Western Blots bestätigte diese Beobachtung. Zusammengefasst kann festgehalten werden, dass S1P5 eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Adenin-induzierter Entzündung in der Niere und nachfolgender Pathogenese wie Gewebeschäden und Fibrose spielt.
Ceramide sind ein Bestandteil der Lipiddoppelschicht, in allen eukaryotischen Zellen vorhanden und zentrale Moleküle des Sphingolipidstoffwechsels. Die Synthese und der Abbau der Ceramide werden von vielen verschiedenen Enzymen reguliert. Neben ihrer Aufgabe als strukturelle Elemente der Zellmembranen wurde herausgefunden, dass Ceramide auch in verschiedenen Signalwegen involviert sind, die auch bei Nierenerkrankungen eine Rolle spielen. In Bezug auf die Kettenlänge der angehängten Fettsäure können so genannte kurz- und langkettige Ceramide Apoptose induzieren, wohingegen sehr langkettige Ceramide Zellproliferation fördern. In mehreren Studien wurden bereits Konzentrationsänderungen von kettenlängenspezifischen Ceramiden im Plasma und Serum von Patienten gemessen, die zu diesem Zeitpunkt an einer Nierenerkrankung litten. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob solche Konzentrationsänderungen auch im Nierengewebe von Patienten und Mäusen mit einer Nierenfibrose, dem Kennzeichen nahezu aller chronischen Nierenerkrankungen, zu sehen sind. Zu diesem Zwecke wurden Biopsien der Nierenrinde und des Nierenmarks von fibrotischen Nieren aus Patienten, die an Hydronephrose und/oder Pyelonephritis litten, und von gesunden Gewebeproben untersucht. Letztere wurden durch Nephrektomien zur Behandlung von Nierenkarzinomen gewonnen und dienten als nichtfibrotische Kontrolle. Zum Vergleich mit fibrotischen Nieren aus Mäusen wurden männliche Mäuse der Linie C57BL/6J mit einer adeninreichen Diät für 14 Tage gefüttert. Die Konzentrationen der Sphingolipide wurden mittels Massenspektrometrie gemessen und die Level der fibrotischen Marker wurden mit Hilfe von RT-qPCR und histologischen Färbungen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die sehr langkettigen Ceramide Cer d18:1/24:0 und Cer d18:1/24:1 sowohl in fibrotischen Nierenrindenproben der Patienten als auch in fibrotischen Nieren der Mäuse im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollproben signifikant geringer konzentriert waren. Diese Effekte korrelieren mit der Hochregulation der Fibrosemarker COL1α1, COL3α1 und αSMA in den fibrotischen Nieren. Es konnte gezeigt werden, dass nur bestimmte Ceramide in fibrotischem Nierengewebe in ihrer Konzentration verändert sind, was interessante Fragen hinsichtlich der Ursache dieser Veränderungen, ihrer funktionellen Aufgabe und zu möglichen Effekten einer Manipulation des Ceramidstoffwechsels mit dem Ziel der Behandlung der Nierenfibrose oder der Entdeckung neuer Biomarker aufwirft. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen zudem die Eignung von in vivo-Mausmodellen als translationalen Ansatz für das Verständnis der Beteiligung von Ceramiden in menschlichen Nierenerkrankungen.
Die in vitro-Untersuchungen zu der Rolle des S1P-Transporters Spns2 haben gezeigt, dass Spns2 die Expression von CTGF nach Stimulation von Mausmesangiumzellen mit TFG-β2 verstärkt. 24 Stunden nach Stimulation war im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC im Gegensatz zu Spns2+/+-mMC keine Akkumulation des pro-fibrotischen Zytokins CTGF gegenüber der unstimulierten Kontrolle detektierbar. Nach 48 Stunden Stimulation mit TFG-β2 war die Menge an CTGF im Zelllysat als auch im Zellkulturüberstand von Spns2-/--mMC genauso hoch wie in der unstimulierten Kontrolle. Im Zelllysat und im Überstand der Spns2-/--mMC war die Expression von CTGF weiterhin deutlich höher im Vergleich zu den Proben der unstimulierten Zellen. Die basale und TFG-β2-induzierte Genexpression von S1P-synthetisierenden und S1P-degradierenden Enzymen, sowie die Konzentrationen an S1P und Sphingosin in den Zellen unterschieden sich zwischen Spns2-/--mMC und Spns2+/+-mMC nicht.
In the title compound, C12H14N22+·2Cl-, the 4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridinium cation is essentially planar (r.m.s. deviation for all non-H atoms = 0.004 Å) and is located on a crystallographic inversion centre. The cations and chloride anions lie in planes parallel to (111) and are connected by N-H...Cl and C-H...Cl hydrogen bonds. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 173 K; mean σ(C–C) = 0.003 Å; R factor = 0.036; wR factor = 0.080; data-to-parameter ratio = 14.7.
Die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichtes in einem mehrzelligen Organismus erfordert Mechanismen, welche die Balance zwischen der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen und der Auslösung einer Immunantwort ermöglichen. Diese Mechanismen werden unter dem Begriff periphere Toleranz zusammengefasst. Regulatorische T-Zellen (Treg) sind eine T-Zell-Subpopulation, die für periphere Toleranz und Homöostase des Immunsystems von großer Bedeutung sind (Powrie et al., 2003). Durch ihre suppressiven Eigenschaften sind Treg in der Lage, die Proliferation von konventionellen T-Zellen (Tcon) sowohl in vivo als auch in vitro zu hemmen und so eine Immunantwort von autoreaktiven TZellen einzudämmen. Für die Hemmung von Tcon in vitro wird der direkte Zellkontakt zwischen Treg und Tcon benötigt (Thornton und Shevach, 1998). Der molekulare Mechanismus humaner Treg ist bislang jedoch nur unzureichend geklärt. In der hier vorgestellten Forschungsarbeit wurden TZR-abhängige Signaltransduktionskaskaden analysiert, um den molekularen Mechanismus humaner Treg sowohl auf Ebene der Treg als auch auf Ebene der gehemmten Tcon zu entschlüsseln. Hierzu wurden im Rahmen der hier beschriebenen Experimente in unserer Abteilung die ex vivo Isolation und die in vitro Expansion humaner Treg etabliert. Mit Hilfe sensitiver Analysemethoden der TZR-abhängigen Signaltransduktionskaskaden konnte für humane Treg gezeigt werden, dass sie nach Stimulation über ihren TZR einen geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zu dem in Tcon aufweisen. Ein weiteres Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit ist, dass Treg im Zuge ihrer Aktivierung eine geringere Phosphorylierung einiger, für die TZR-induzierte-Signalkaskade relevante Signalmoleküle wie ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Für gehemmte Tcon aus der Kokultur mit humanen Treg wurde in dieser Forschungsarbeit ein zu Kontroll-Tcon vergleichbarer Ca2+-Einstrom detektiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen außerdem, dass Tcon aus der Kokultur mit Treg eine verringerte Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Die hier veröffentlichten Ergebnisse ermöglichen einen ersten Einblick in die molekulare Signaltransduktion von humanen Treg und zum ersten Mal auch in die von gehemmten Tcon. Dieses Verständnis stellt eine Grundlage für weitere Experimente dar und ermöglicht einen Schritt in Richtung der vollständigen Entschlüsselung des molekularen Mechanismus humaner Treg, die eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz dieser Zellen ist. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Immunantwort zu untersuchen. Für die Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen ist die effiziente und immunologisch unauffällige Eliminierung apoptotischer Zellen unabdingbar (Fadok et al., 1998; Lauber et al., 2004; Skoberne et al., 2005; Steinman und Nussenzweig, 2002). Im Rahmen der hier erläuterten Experimente wurden in vitro Studien durchgeführt, die einen inhibierenden Effekt apoptotischer Zellen auf die Reifung humaner dendritischer Zellen zeigen. Es konnte bestätigt werden, dass dendritische Zellen nach Phagozytose apoptotischer Zellen weniger proinflammatorische Moleküle sekretieren und eine geringere Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle aufweisen. Nach Etablierung zweier in vitro Modellsysteme wurde in weiteren Experimenten gezeigt, dass T-Zellen durch dendritische Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben, eine geringere Stimulation erfahren. Diese Ergebnisse deuten auf einen anti-stimulatorischen Effekt dendritischer Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben hin, und sie bilden die Basis für eine anschließende in vitro Analyse der molekularen Auswirkungen auf dendritische Zellen und T-Zellen.
Host cell invasion by the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes requires the invasion protein InlB in many cell types. InlB consists of an N-terminal internalin domain that binds the host cell receptor tyrosine kinase Met and C-terminal GW domains that bind to glycosaminoglycans (GAGs). Met binding and activation is required for host cell invasion, while the interaction between GW domains and GAGs enhances this effect. Soluble InlB elicits the same cellular phenotypes as the natural Met ligand hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), e.g. cell scatter. So far, little is known about the central part of InlB, the B-repeat. Here we present a structural and functional characterization of the InlB B-repeat. The crystal structure reveals a variation of the β-grasp fold that is most similar to small ubiquitin-like modifiers (SUMOs). However, structural similarity also suggests a potential evolutionary relation to bacterial mucin-binding proteins. The B-repeat defines the prototype structure of a hitherto uncharacterized domain present in over a thousand bacterial proteins. Generally, this domain probably acts as a spacer or a receptor-binding domain in extracellular multi-domain proteins. In cellular assays the B-repeat acts synergistically with the internalin domain conferring to it the ability to stimulate cell motility. Thus, the B-repeat probably binds a further host cell receptor and thereby enhances signaling downstream of Met.
The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells.
This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery.
For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library.
The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen.
The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
"Ästhetisch ist, was hilft"
(2017)
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Regiospezifität und Spaltungsausbeute von 5’-modifizierten Trisbenzimidazolkonjugaten wie 53 unter Verwendung von Helfer-Sequenzen verbessert werden (S.74 ff). Mit dieser Technik gelang es, Turnover zu erzielen und so eine echte katalytische Aktivität der DNA-Konjugate nachzuweisen. Die verwendeten Helfer-DNA-Sequenzen sind günstig zu erwerben oder mit einem DNA-Synthesizer leicht selbst herzustellen und können so der jeweiligen Aufgabe perfekt angepasst werden.
Weiterhin wurden verschiedene Versuche unternommen, ein 5’-modifiziertes Konjugat maßzuschneidern, so dass es durch interne bulge-Bildung mit seinem Substrat ebenfalls Turnover erreichen könnte und so katalytische Aktivität zeigte (S.59 ff). Diese Projekte wurden in Anlehnung an Arbeiten von Häner [91] durchgeführt, der damit Turnover erzielte, da das Konjugat nach Spaltung des bulges wieder in den katalytischen Zyklus eingegliedert werden konnte. Leider waren diese Versuche nicht von Erfolg gekrönt, obwohl man sich bei der Konzipierung der Substrat-Konjugat-Hybriden an die Sequenzen von Häner et.al. hielt. Statt dessen beobachtete man im Falle von Konjugat 51 bei der Hybridisierung die Ausbildung einer Helix; ein bulge konnte nicht erhalten werden (S. 61). Dieser Unterschied könnte auf die große, planare Spaltereinheit mit Europium(III) von Häner et. al. zurück zu führen sein, die im Falle der von uns untersuchten Konjugat-Substrat-Hybride fehlte, denn die 2-Aminobenzimidazol-Einheiten von Trisbenzimidazol 15 waren im Vergleich als klein anzusehen.
Diese Vermutung führte schließlich zu zwei unterschiedlichen Ansätzen. Einer davon war es, eine größere intercalationsfähige Teilstruktur in das Konjugat einzuführen. Man versuchte deshalb ein Konjugat zu synthetisieren, welches zwischen der katalytischen Einheit und dem sequenzerkennenden Teil die Pyrenaminosäure 56 von Dr. M. Suhartono trug (S. 69 ff).
Dieses sollte den großen, Häner’schen Rest imitieren und so einen bulge erzeugen. Leider gelang die Synthese dieses Konjugates nicht. Wie sich heraus stellte, war das kommerziell erworbene DNA-Material nicht geeignet für die angewendete Synthese. Eine Basen-Schutzgruppe bzw. das Anhydrid derselben, welches bei der Festphasensynthese als Capping-Reagenz verwendet wurde, führte zu einer irreversiblen Reaktion mit der 5'-NH2-Funktion an der DNA und machten das Material daher für eine Kupplung unbrauchbar.
Eine andere Herangehensweise war es, die Faltung des Konjugat-Substrat-Hybrides voraus zu berechnen und so ein Hybrid zu erhalten, welches einen bulge ausbildete (S. 65 ff). Konjugat 55 und Substrat 54 wurden nach dieser Strukturvorhersage synthetisiert bzw. erworben und entsprachen genau den Erwartungen, ein interner bulge wurde ausgebildet. Dennoch konnte man auch mit diesem System keinen Turnover erreichen.
Ein weiteres großes Teilgebiet dieser Arbeit war die Untersuchung kleiner Moleküle als unspezifische RNA-Spalter. Im Rahmen dieser Arbeit wurden speziell Guanidiniumanaloga auf ihre RNA-Spaltungsfähigkeit untersucht. In der Vergangenheit hatte man als Gütekriterium dieser Verbindungen das Augenmerk auf ihre pKa-Werte gerichtet. Sofern sich diese annähernd im physiologischen Bereich befanden, konnten häufig gute bis sehr gute RNA-Spaltungsausbeuten erzielt werden.
Erstmals kam das Konzept der Energiedifferenz zwischen den tautomeren Formen eines guanidiniumtragenden Moleküls als Werkzeug zur Vorhersage der Güte eines RNA-Spalters zum Einsatz (S.113 ff). Sofern die beiden Strukturen (Amino- und Iminotautomer) sehr geringe Energieunterschiede aufwiesen, sollten sie sich besser als „Protonen-Shuttle“ eignen und so die Phosphosäuretransesterifikation katalytisch besser unterstützen. Zusammen mit dem pKa-Wert der Verbindungen wurde untersucht, ob dieses Konzept als Vorhersagemethode tragfähig ist.
Unter den mit diesen Methoden gefundenen sowie kommerziell erhältlichen Molekülen konnte 2-Aminoperimidin 67 als sehr guter Spalter identifiziert werden. Verglichen mit Trisbenzimidazol 15 erreichte es ebenso gute Spaltungsraten wie letzteres, wobei 67 nur über eine einzige Guanidiniumeinheit verfügt. Dieser so identifizierte neue Kandidat für den Einbau in DNA-Konjugate enttäuschte auch nach Untersuchungen seines N-Methyl-Aminoderivates 80 nicht: Das Derivat zeigte eine ausreichend hohe Spaltungsaktivität, um es in Zukunft als Baustein für antisense-Konjugate in Frage kommen zu lassen.
Es gab allerdings auch Schwierigkeiten bei der Untersuchung der kleinen Moleküle. Problematisch gestaltete sich ihre Löslichkeit in hohen Konzentrationen. Man ging deshalb dazu über, Co-Solventien wie Methanol oder DMSO zu verwenden, um auch während des Experimentes eine ausreichende Löslichkeit der Verbindungen zu gewährleisten. Ein Volumenanteil von 20% Co-Solvens stellte sich als ideal heraus, das Experiment wurde dadurch nicht negativ beeinflusst.
Außerdem kam es zu Präzipitation einiger Substanzen (u.a. 2-Aminoperimidin 67) beim Auftragen auf das Sequenzierergel, welche die Auswertbarkeit dieser Experimente einschränkte. Die Verwendung eines neuen Harnstoffladepuffers beim Auftragen der Proben auf das Gel und das Senken der Substanzkonzentration (von mM auf μM) im Experiment verbesserten diese Situation deutlich. Häufig beobachtete Präzipitationseffekte waren danach größtenteils verschwunden, was die Auswertung der Spaltungsexperimente mit kleinen Molekülen erleichterte (S. 129 ff). Einige Verbindungen konnten mit der Kombination von ΔHf-Wertbestimmung und pKa-Wert-Bestimmung als schlechte RNA-Spalter korrekt vorhergesagt werden (z.B. 2-Aminopyridin 69, 2- Aminopyrimidin 68).
Nicht ganz klar ist das mittelmäßige Abschneiden von Imidazoimidazol 71 als RNA-Spalter (S.136 ff). Durch seine Symmetrie liegt sein ΔHf-Wert bei 0 und auch sein pKa-Wert liegt mit 7.4 perfekt im physiologischen Bereich. Dennoch konnte es nur Spaltungsausbeuten von unter 10% bei Konzentrationen im höheren mM-Bereich erreichen. Es ist aber auch die einzige untersuchte Verbindung, die signifikant RNA schneidet, ohne diese gleichzeitig zu aggregieren oder zu denaturieren.
Untersuchungen des Aggregationsverhaltens der kleinen Moleküle mittels FCS-Messungen (S. 139 ff) zeigten, dass fast alle bei hohen Konzentrationen – etwa im mM- oder hohem μMBereich – Aggregate bilden, und das auch bei Verwendung von Co-Solventien, wie es im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Man kann also bei den kleinen Katalysatoren nicht davon ausgehen, dass isolierte Moleküle für die beobachteten Effekte verantwortlich sind. Vielmehr agieren diese Moleküle bei solchen Konzentrationen als große oder kleine Aggregate, die durch die Vielzahl ihrer katalytischen Einheiten an der Oberfläche ihr Potential vervielfachen. Erst bei niedrigen Konzentrationen lösen sich die Aggregate auf, man kann hier wieder von einem Ein-Molekül-ein-Substrat-Mechanismus ausgehen (s. Schema 3 S. 110).
Dies wird allerdings nicht als Ausschlusskriterium gesehen, diese Moleküle auch weiterhin als potentielle Kandidaten für antisense-Konjugatbausteine zu betrachten. In Konjugaten verhalten sie sich wie Einzelmoleküle, bei denen man streng mechanistische Betrachtungen anstellen kann und darf.
Almost two decades ago, microRNAs were discovered as novel posttranscriptional regulators of gene expression. Since then, research efforts have uncovered their involvement in the control of various cellular processes including migration, proliferation and cell survival. Even more complex events, such as the formation of new blood vessels or organ development, have been shown to be tightly regulated and orchestrated by microRNAs. Due to their crucial regulatory role in tissue homeostasis in vertebrates, it does not come as a big surprise that dysregulated microRNA ex-pression is associated with pathology of diverse diseases. In this regard, the miR-17-92 cluster is a prime example since it has become famous for its amplified expression in tumours and its on-cogenic potential. Our lab demonstrated the expression of the members of the miR-17-92 cluster, namely miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b and -92a, in endothelial cells and provided evidence for the anti-angiogenic activity of miR-92a in ECs as well as its important regulatory role in tissue re-covery after ischemia. In this work we addressed the function of the remaining members of the miR-17-92 cluster, i.e. miR-17, miR-18a, miR-19a and miR-20a, in endothelial cells and angiogenesis. Surprisingly, the individual members all displayed anti-angiogenic properties in endothelial cells in vitro, although overexpression of the whole cluster in transformed colonocytes was shown to promote tumour angiogenesis in a mouse model. In this context, we provide evidence that the individual miRs differentially affect the paracrine angiogenic activity of endothelial and tumour cells. Moreover, Antagomir-mediated inhibition of miR-17/20 in a mouse tumour model did not affect tumour angi-ogenesis, although miR-17/20 inhibition profoundly increased vascularization of Matrigel plugs. Thus, our research efforts suggest a differential involvement of the members of the miR-17-92 cluster in physiological and tumour angiogenesis. Additionally, we identified Janus kinase (JAK) 1 as a novel miR-17 target in endothelial cells and demonstrated the involvement of JAK1 in angio-genesis and in the phosphorylation of STAT3 in response to different cytokines in vitro. Overall, inhibition of specific members of the miR-17-92 cluster might represent an attractive therapeutic strategy to enhance angiogenesis in ischemic diseases. In the second part of the present work we investigated the therapeutic value of Antagomir-mediated microRNA inhibition in animal models of pulmonary arterial hypertension. Collectively, inhibition of miR-17 by the respective Antagomir revealed a significant improvement of pulmonary hemodynamics and cardiac function in both the chronic hypoxia mouse model and the mono-crotaline-induced lung injury rat model. Histomorphometric analysis of the lungs of the pulmonary hypertensive mice and rats uncovered a significant reduction of disease associated musculariza-tion of pulmonary arteries in Antagomir-17 treated animals compared to the control animals indicating interference with smooth muscle cell proliferation or survival. Probing of lung tissue of the pulmonary hypertensive rats for selected miR-17 targets uncovered a profound increase in the expression of the cyclin dependent kinase inhibitor p21 in the Antagomir-17 treated rats suggest-ing that inhibition of miR-17 impairs proliferation by impeding cell cycle progression. Analysis of miR-17 function in human smooth muscle cells in vitro corroborated the results from the animal experiments by demonstrating pro-proliferative activity of miR-17 and decreased levels of p21 in these cells. Collectively, our results indicate that Antagomir-17 improves pulmonary hemodyna-mics and cardiac function by interfering with vascular remodelling within the lung. Hence, inhibi-tion of miR-17 might be of therapeutic value to ameliorate the disease pattern in pulmonary arte-rial hypertension. In summary, the present work provides insights into the regulatory functions of members of the miR-17-92 cluster, especially miR-17, in blood vessels and suggests that specific inhibition of members of the miR-17-92 cluster might be a novel option to treat vascular diseases.
Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.
Es wurde die Photodynamik freier kolloidaler CdSe Quantenpunkte sowie die Elektronentransfer(ET)-Dynamik im System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen mit Hilfe der Femtosekunden-Laserspektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Die freien CdSe Quantenpunkte wiesen eine multiphasische Rekombinationsdynamik der photoinduzierten Exzitonen auf, was durch das Vorhandensein von Quantenpunkten mit unterschiedlichem Passivierungsgrad innerhalb einer Quantenpunktprobe erklärt wurde. Sowohl die Rekombinationsdynamik des Exzitons als auch die Intraband-Relaxation von Elektron und Loch besaßen eine Abhängigkeit von der Partikelgröße. Die 1P-1S-Relaxationzeit des Elektrons betrug in Partikeln mit Durchmessern von 3 nm und 6,3 nm 0,12 ps bzw. 0,24 ps, woraus sich Energieverlustraten von 1,0 eV/ps und 3,8 eV/ps berechnen ließen. Die sehr schnelle Natur der 1P-1S-Relaxation und die gefundene Größenabhängigkeit stehen im Einklang mit dem vermuteten Auger-artigen Energietransfer vom hochangeregten Elektron auf das Loch. Durch diesen Prozess kann das theoretisch vorhergesagte „phonon bottleneck“ effizient umgangen werden. Zudem konnte eine größenabhängige Biexziton-Bindungsenergie zwischen 40 meV und 28 meV ermittelt werden. Die Untersuchung von Multiexzitonen in CdSe Quantenpunkten zeigte einen schnellen Zerfallskanal. Es handelt es sich um die Auger-Rekombination. Die Rekombination nach 1P-Anregung wurde in Form von sequenziellen Schritten N, N-1, N-2,..., 1 interpretiert. Für das System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen wurde war eine Zunahme der ET-Rate bei steigender Akzeptorkonzentration zu beobachten, die mit der Zunahme von Akzeptorzuständen erklärt werden kann. Ferner wurde eine maximale ET-Rate erreicht, die bei einer weiteren Erhöhung der Akzeptorkonzentration nicht überschritten wird. In weiteren Versuchsreihen konnte gezeigt werden, dass die Größe der Partikel einen Einfluss auf den ET-Prozess zwischen Quantenpunkt und Methylviologen hat. Eine kombinierte Studie, in der sowohl das Quantenpunkt/Methylviologen-Verhältnis als auch die Quantenpunktgröße variiert wurde, verdeutlichte, dass eine Verkleinerung der Partikel zu einem Anstieg der ET-Rate führt. Die Variation der Partikelgröße geht mit einer Veränderung der Triebkraft der ET-Reaktion im gekoppelten System einher. Der gefundene Zusammenhang zwischen der Triebkraft der Reaktion und der ET-Rate ist gut mit der Marcus-Theorie vereinbar. In einer Serie von Experimenten am Quantenpunkt/Methylviologen ET-System wurde die Anregpulsenergie variiert, um den Einfluss von Multiexzitonen auf den Elektronentransfer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass nach Mehrfachanregung der Quantenpunkte die Separation von bis zu vier Elektron-Loch-Paaren möglich ist. Für den Elektronentransfer im untersuchten ET-System wurde eine ET-Zeit von ca. 200 fs ermittelt. Diese ist deutlich kürzer als die gefundenen Auger-Rekombinationszeiten, die sich zwischen 1,5 ps und 5 ps bewegen. In einer Studie an CdSe/CdS Kern/Schale Partikeln wurde der Einfluss einer passivierenden anorganischen Schale auf den ET-Prozess untersucht. Bei der gewählten Heterostruktur handelte es sich um Typ I Kern/Schale Partikel, in denen sowohl Elektron und Loch hauptsächlich im Kern eingeschlossen sind. Es wurde ein exponentieller Abfall der ET-Rate mit wachsender Schalendicke beobachtet, weshalb davon auszugehen ist, dass die CdS-Schale als elektronische Barriere wirkt, durch die das photoangeregte Elektron tunneln muss, um mit dem Akzeptor reagieren zu können. Schließlich wurde der Einfluss des Elektronentransfers im ET-System auf die Entstehung von Phononen untersucht. Sowohl in freien Quantenpunkten als auch im gekoppelten System konnte das LO sowie das LA Phonon beobachtet werden, wobei das LA Phonon im gekoppelten System stark unterdrückt ist. Im Falle der freien Quantenpunkte sind die beobachteten Oszillationen eine Folge der Frequenzmodulation der Absorption des angeregten Zustandes. Mit Hilfe des Huang-Rhys-Parameters ließ sich ermitteln, wie stark in freien Quantenpunkten das LO Phonon an das Exziton gekoppelt ist. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter betrug 0,012. Im Falle des gekoppelten Systems weist die spektrale Signatur der kohärenten Oszillationen darauf hin, dass diese durch die Frequenzmodulation der linearen QP-Absorption verursacht werden. Im Falle des gekoppelten Systems sind die beobachteten Phononen nicht an das Exziton sondern an die ET-Reaktion gekoppelt, d. h. der ET selbst induziert Gitterschwingungen im Reaktionsprodukt. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter, der die ET-Phonon-Kopplung beschreibt, berechnete sich ebenfalls zu 0,012, was verdeutlicht, dass die ET-Phonon-Kopplung ähnlich stark wie die Exziton-Phonon-Kopplung ist. Mit Hilfe der spektralen Abhängigkeit der Oszillationen in freien Quantenpunkten und im gekoppelten System ließ sich eine Biexziton-Bindungsenergie von 35 meV berechnen.
Formation of the anteroposterior and dorsoventral body axis in Caenorhabditis elegans depends on cortical flows and advection of polarity determinants. The role of this patterning mechanism in tissue polarization after formation of cell-cell contacts is not fully understood. Here, we demonstrate that planar asymmetries are established during left-right symmetry breaking: Centripetal cortical flows asymmetrically and differentially advect anterior polarity determinants (aPARs) from contacts to the medial cortex, resulting in their unmixing from apical myosin. Contact localization and advection of PAR-6 requires balanced CDC-42 activation, while asymmetric retention and advection of PAR-3 can occur independently of PAR-6. Concurrent asymmetric retention of PAR-3, E-cadherin/HMR-1 and opposing retention of antagonistic CDC-42 and Wnt pathway components leads to planar asymmetries. The most obvious mark of planar asymmetry, retention of PAR-3 at a single cell-cell contact, is required for proper cytokinetic cell intercalation. Hence, our data uncover how planar polarity is established in a system without the canonical planar cell polarity pathway through planar asymmetric retention of aPARs.
Biological membranes separate the cell interior from the outside and have diverse functions from signal transduction, apoptosis to transportations of ions and small molecules in and out of the cell. Most of these functions are fulfilled by proteins incorporated in the membrane. However, lipids as the main component of membrane not only serve as structural element for bilayer formation but they are also directly involved e.g. signalling processes and bilayer properties are important to mediate protein interactions. To fully understand the role of lipids, it is necessary to develop a molecular understanding of how certain membrane components modify bulk bilayer structure and dynamics. Membranes are known to have many different motions in different conditions and time scales. Temperature, pH, water content and many other conditions change membrane dynamics in a high degree. In addition to this, time scales of motions in membranes vary from ns to ms range corresponding to fast motion and slow motion, respectively. Therefore, membranes are needed to be studied systematically by varying the conditions and using methods to investigate motions in various time scales separately. The aim of this study was therefore perform a combined solid-state NMR / molecular dynamics study on model membranes. Different substrates, such as potential drugs, polarizing agents and signaling lipids were incorporated into bilayers and their location within the membrane and their effect onto the membrane was probed. NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs), pirinixic acid derivatives, ceramides and polarizing agents were the substrates for membranes in this study. There were several experimental methods that were applied in order to investigate effects of these substrates on membrane dynamics. Different kind of phospholipids including POPC, DMPC and DPPC were used. In addition to experimental work, with the information gathered from solid state NMR experiments molecular dynamics simulations were performed to obtain more information about the membranes at the molecular level. As a result, combination of solid-state NMR with molecular dynamics simulations provides very systematic way of investigating membrane dynamics in a large range of time scales.
Pirinixic acid derivatives were special interest of this study because of their activity on peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) as an agonist as well as on enzymes of microsomal prostaglandin E2 synthase-1 (PGE2s) -1 and 5-lipoxygenase (5-LO) as dual inhibitor. Two potent pirinixic acid derivatives, 2-(4-chloro-6-(quinolin-6-ylamino)pyrimidin-2-ylthio)octanoic acid (compound 2) and 2-(4-chloro-6-(quinolin-6-ylamino)pyrimidin-2-ylthio)octanoate (compound 3), have been worked and their insertion depts were investigated by combining of solid state NMR and molecular dynamics simulations. Both experimental and theoretical results pointed out that compound 3 was inserted the phospholipid bilayer more deeply than 2. NSAIDs – lipid mixtures have been also studied here. It is known that consumption of NSAIDs as in mixture with lipids results much fewer side effects than consumption of the drugs alone. Thus, it is crucial to understand interactions of NSAIDs with lipids and investigate the possible complex formation of drugs with lipids. In this study, interactions of three widely used NSAIDs, ibuprofen, diclofenac and piroxicam, with DPPC were investigated by solid-state NMR. 1H and 31P NMR results depicted that ibuprofen and diclofenac had interactions with lipids, which is an indication of drug-lipid complex formation whereas piroxicam didn’t show any interactions with lipids suggesting that no complex formation occurred in the case of piroxicam. Ceramides are known to play key roles in many cell processes and many studies showed that the functions of ceramides are related with the ceramide effects on biological membranes. Therefore, in this study, influences of ceramides on biophysics of lipid bilayers were investigated by using various solid state NMR techniques and molecular dynamics simulations. Results from molecular dynamics simulations clearly showed that ceramide and lipids have strong interactions. More evidences about ceramide-lipid interactions were provided from 1H and 14N NMR results. In addition, it was indicated by both simulation and experimental methods that ceramide increased the rigidity of DMPC by increasing chain order parameters. BTbk is a biradical, which is used as polarizing agent for dynamic nuclear polarization (DNP) experiments and found to be more efficient than other widely used polarizing agents such as TOTAPOL. Since it is a hydrophobic compound, which prefers to stay inside lipid bilayer it is important to investigate the location and orientation of bTbk along the bilayer in order to understand its enhancement profile in DNP measurements. In this study, both NMR relaxation time measurements and molecular dynamics simulations revealed that bTbk tends to stay more close to hydrophobic chain of lipids than the interfacial part of lipids at bilayer surface.
In the first part of this work, a brief introduction on lipid membranes as well as a theoretical summary on both methods of solid-state NMR and molecular dynamics simulations is given. Then, in the second part methodology is introduced for both solid-state NMR spectrometer and theoretical calculations. Afterwards, results of different membrane systems are discussed in the following parts for both solid state NMR and MD. Finally, in the last part, a summary and the conclusion of the overall results together with some future plans are explained.
Antibiotic treatment of tuberculosis (TB) is complex, lengthy, and can be associated with various adverse effects. As a result, patient compliance often is poor, thus further enhancing the risk of selecting multi-drug resistant bacteria. Macrophage mannose receptor (MMR)-positive alveolar macrophages (AM) constitute a niche in which Mycobacterium tuberculosis replicates and survives. Therefore, we encapsulated levofloxacin in lipid nanocarriers functionalized with fucosyl residues that interact with the MMR. Indeed, such nanocarriers preferentially targeted
MMR-positive myeloid cells, and in particular, AM. Intracellularly, fucosylated lipid nanocarriers favorably delivered their payload into endosomal compartments, where mycobacteria reside. In an in vitro setting using infected human primary macrophages as well as dendritic cells, the encapsulated antibiotic cleared the pathogen more efficiently than free levofloxacin. In conclusion, our results point towards carbohydrate-functionalized nanocarriers as a promising tool for improving TB treatment by targeted delivery of antibiotics.
The ribonucleic acid of reovirus was extracted with 2 M sodium perchlorate solution and spread by the protein monolayer technique. Areas of the monolayer were transferred to support films, rotary shadowed, and observed in the electron microscope. Filaments of RNA obtained by extraction prior to spreading were similar in appearance and in distribution of contour lengths (0.2 to 1.2 μ) to those obtained by phenol extraction of the virus. Most of the filaments resulting from extraction of the virus suspension during spreading on a sodium perchlorate solution, however, were longer than 1 μ. The lengths of the longest filaments exceeded the 5 μ length predicted from chemical data for one single piece of complementary-stranded RNA in the reovirus particle.
The short filaments, 1.2 μ and less in length, fell into a tri-modal pattern of length distribution with peaks at 0.35 μ, 0.60 μ and 1.10 μ. These shorter lengths probably resulted from breakage of the intact RNA during the extraction procedures. The consistently observed pattern of length distribution suggests that they represent relatively stable subunits of the molecule.
Sodium perchlorate extracted reovirus RNA was thermally denatured in formaldehyde prior to spreading by the protein monolayer technique. Length distributions and relative numbers of filaments in the peaks of the tri-modal distribution pattern were similar to those found for unheated material when extracted prior to spreading. This similarity indicates that heating subsequent to extraction produced no further filament breakage. The thin, kinky appearance of the heated filaments, and the appearance of congruent pairs, indicated that heating had separated the strands of the complementary-stranded RNA subunits.
The title compound, C26H18BrNO4, features a functionalized chromene. The cyclohexene ring adopts a sofa conformation and has the nitro group and the bromophenyl ring in an axial position. The ten atoms of the chromene moiety lie close to a common plane (r.m.s. deviation = 0.066 Å). The attached phenyl ring is twisted by 32.89 (10)° from the chromene plane. The crystal packing is stabilized by C—H[cdots, three dots, centered]O interactions.
3,17 β-Hydroxysteroid dehydrogenase has been enriched and purified from cytosol of Streptomyces hydrogenans. After ammonium sulfate precipitation and filtration on Sephadex G-100 the enzyme was finally purified by preparative gel electrophoresis and DEAE-Sephadex A-50 chromatography. Polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate gave a single band of mobility corresponding to molecular weight of 70 200 ± 2 500. 3 β-. 17 β- as well as 20 β-hydroxy steroids were dehydrogenated by the enzyme in the presence of NAD+. The dehydrogenation proceeded faster than the reduction of the corresponding ketosteroids in the presence of NADH. The enzyme does not accent NADP+ or NADPH as co-substrates. The apparent Km values were calculated to be 11 μᴍ for 5 α-dihydrotestosterone, 20 μᴍ for testosterone ana 68 μᴍ for epiandrosterone in the NAD+-driven reaction, 1.8 x 10-4 m for NADH+ and 1.9 x 10-4 ᴍ for NADH. The catalytic activity was influenced by the ratio of NAD+/ATP. The inhibition by ATP appears to be of a competitive type with respect to NAD+ (Ki 1.15 x 10-3 ᴍ).
After sucrose gradient centrifugation in a preparative ultracentrifuge the enzyme sediments with 4.1 ± 0.1 S as estimated in comparison to other proteins of known sedimentation coefficient. The isoelectric point was determined to be 3.9 with the LKB preparative isoelectric focusing column (pH 2-11) and 4.1 with the analytical flat bed polyacrylamide isofocusing (pH 3 - 5). The number of SH groups was determined to be 2 mol/mol enzyme. In the presence of 6 M urea the figure inceases to 3 mol SH/mol enzyme. In the presence of an excess of p-chloromercuribenzoate the enzyme activity decreases only partially.
Although in general cells are genetically identical in multicellular organisms, the differential expression of genomic information enables cell type definition and specific organ function. In eukaryotic cells, the DNA is associated with histone and non-histones proteins into a restrictive structure called chromatin. Assembly into chromatin does not only protect and package the linear double stranded DNA into the nucleus but is fundamental for the execution of diverse genetic programs. Posttranslational modifications of histones regulate the accessibility of the DNA to transcription factors and serve as scaffold for binding of regulatory proteins. Nuclear receptors are transcription factors that bind specific target sequences on the DNA and recruit transcriptional coregulators at the promoter. These are able to modify the chromatin structure in an activating or repressing manner. The contribution of corepressors to the biological actions of nuclear receptors has turned out to be essential. Impaired corepressor function can be the cause of endocrine malfunctions, neoplastic diseases or severe developmental abnormalities. To better understand the role of the nuclear receptor corepressor N-CoR the unknown function of the extreme C-terminus was investigated. In this thesis the interaction of N-CoR with the non-POU-domain containing octamer-binding protein Non0/p54nrb, that was found tobe a potential interaction partner in a yeast-two-hybrid screen, was confirmed. This protein contains two RNA recognition motifs (RRM) and is described as a multifunctional protein since it is involved in transcription Initiation as well as in pre-mRNA processing. The RRM1 motif was determined to be essential and sufficient for the interaction with N-CoR. Obtaining dominant negative effect with the Non0/p54nrb RRM1 deletion mutant in functional reporter assays, data support that NonO modulates the capacity of N-CoR to repress and alters the recruitment of N-CoR by nuclear receptors to targeted Promoters. Additional analyses suggest that the N- and C- terminus of N-CoR are involved in intramolecular interactions and that they regulate each other. Taken results together a functional model is proposed that supports the biological relevance of the interaction of N-CoR with NonO and the function of N-CoR C-terminus acting as asensor that evaluates the ratio of corepressors and coactivators in the nuclear receptor environment. N-CoR repressive capacity would be altered by modulating factors like NonO that interacts with N-CoR C-terminus. The mechanism support that splicing and transcription regulation are physically and functionallylinked to ensure the appropriate amount of messager RNA to be transcript and process in response to stimulation intensity and cell context.
Mitochondrial complex I, the largest and most complicated proton pump of the respiratory chain, links the electron transfer from NADH to ubiquinone to the pumping of four protons from the matrix into the intermembrane space. In humans, defects in complex I are involved in a wide range of degenerative disorders. Recent progress in the X-ray structural analysis of prokaryotic and eukaryotic complex I confirmed that the redox reactions are confined entirely to the hydrophilic peripheral arm of the L-shaped molecule and take place at a remarkable distance from the membrane domain. While this clearly implies that the proton pumping within the membrane arm of complex I is driven indirectly via long-range conformational coupling, the molecular mechanism and the number, identity, and localization of the pump-sites remains unclear. Here, we report that upon deletion of the gene for a small accessory subunit of the Yarrowia complex I, a stable subcomplex (nb8m delta) is formed that lacks the distal part of the membrane domain as revealed by single particle analysis. The analysis of the subunit composition of holo and subcomplex by three complementary proteomic approaches revealed that two (ND4 and ND5) of the three subunits with homology to bacterial Mrp-type Na+/H+ antiporters that have been discussed as prime candidates for harbouring the proton pumps were missing in nb8m delta. Nevertheless, nb8m delta still pumps protons at half the stoichiometry of the complete enzyme. Our results provide evidence that the membrane arm of complex I harbours two functionally distinct pump modules that are connected in series by the long helical transmission element recently identified by X-ray structural analysis.
Air pollution of particulate matter (PM) from traffic emissions has a significant impact on human health. Risk assessments for different traffic participants are often performed on the basis of data from local air quality monitoring stations. Numerous studies demonstrated the limitation of this approach. To assess the risk of PM exposure to a car driver more realistically, we measure the exposure to PM in a car cabin with a mobile aerosol spectrometer in Frankfurt am Main under different settings (local variations, opened versus a closed window) and compare it with data from stationary measurement. A video camera monitored the surroundings for potential PM source detection. In-cabin concentrations peaked at 508 µg m−3 for PM10, 133.9 µg m−3 for PM2.5, and 401.3 µg m−3 for coarse particles, and strongly depended on PM size and PM concentration in ambient air. The concentration of smaller particles showed low fluctuations, but the concentration of coarse particles showed high fluctuations with maximum values on busy roads. Several of these concentration peaks were assigned to the corresponding sources with characteristic particle size distribution profiles. The closure of the car window reduced the exposure to PM, and in particular to coarse particles. The mobile measured PM values differed significantly from stationary PM measures, although good correlations were computed for finer particles. Mobile rather than stationary measurements are essential to assess the risk of PM exposure for car passengers.
Sauerstoff wird in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Atmungsketten von der Cytochrom c Oxidase zu Wasser reduziert. Dieses Enzym besteht in Paracoccus denitrificans aus vier Untereinheiten, von denen aber nur die ersten zwei für die Funktion essentiell sind. Elektronen werden von einem membrangebundenen Cytochrom c552 zunächst auf das CuA-Zentrum der Untereinheit II der Oxidase übertragen und gelangen von dort zum low-spin Häm a der Untereinheit I. Am binukleären Zentrum, das aus dem high-spin Häm a3 und dem CuB-Atom besteht, erfolgt schließlich die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Bindungsstelle für Cytochrom c durch das gezielte Einführen oder Entfernen negativer Ladungen auf der Oxidase-Oberfläche zu bestimmen. Die Charakterisierung dieser Mutanten erfolgte hauptsächlich durch spektroskopische Analyse der kinetischen Parameter unter Umsatzbedingungen. Zusätzlich wurde der Teilschritt der Susbtratbindung durch die Aufnahme von Assoziationskinetiken untersucht. Als Substrat diente das reduzierte mitochondriale Cytochrom c oder ein lösliches Fragment des Paracoccus-Cytochrom c552. Die eingeführten Mutationen beeinflußten in unterschiedlicher Weise die Bindung der beiden verwendeten Substrate. Hierbei ist der negativ geladene Bereich der Oberfläche von Untereinheit II der Oxidase, der zur Bindung des Paracoccus-eigenen Substrats beiträgt, größer als der für die Wechselwirkung mit dem mitochondrialen Cytochrom c. Erstmals kann somit ein Modell für die Bindung des nativen Substrats an die Paracoccus-Oxidase aufgestellt werden. Die aa3-Oxidase aus Paracoccus zeigte keine Elektronentransfereaktion mit dem Cytochrom c552 aus Thermus thermophilus, da dessen Oberfläche nicht die hierfür erforderlichen Ladungen trägt. Durch Erhöhung der Hydrophobizität auf der Untereinheit II der Paracoccus-Oxidase wurde deren Oberfläche so verändert, dass sie nunmehr auch durch dieses „hydrophobe“ Cytochrom c reduziert werden konnte. Der Aminosäurerest W121 auf der Oberfläche der Untereinheit II wurde in der Vergangenheit als ein möglicher Elektroneneintrittsort in die Cytochrom c Oxidase beschrieben. Die in der vorliegenden Arbeit an dieser Position hergestellten Mutanten zeigten zwar drastische Einbußen in den maximalen Wechselzahlen, aber eine weitgehend unveränderte Affinität zum Cytochrom c. Die exakte Positionierung der Seitengruppe des Tryptophans spielt hierbei gegenüber der Aromatizität die entscheidende Rolle. An benachbarten Positionen eingeführte Mutationen ergaben keine Hinweise auf alternative Elektroneneintrittsorte. Durch ortsspezifische Mutagenese auf dem löslichen Cytochrom c552-Fragment wurden die Lysine auf der Oberfläche entfernt, um zu klären, ob die Wechselwirkung zwischen Cytochrom c und Oxidase auf Ladungspaaren beruht oder über das Gesamtpotential der Bindungsstellen bestimmt wird. Die Lysin-Mutanten zeigten alle im gleichen Maße eine reduzierte Affinität zur Oxidase. Die vorliegenden Ergebnisse lassen den Schluß zu, dass die Wechselwirkung zwischen Oxidase und Cytochrom c552 über das Gesamt-Oberflächenpotential vermittelt wird. Steady-state-Kinetiken unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrom c oder Paracoccus Cytochrom c552 weichen von den klassichen Michaelis-Menten-Verhalten ab, da zwei separate Phasen für die Kinetik beobachtet werden. Dieses Phänomen bisher wurde mit der Anwesenheit einer zweiten Bindungsstelle oder einer redoxgekoppelten Konformationsänderung der Oxidase erklärt. Durch Untersuchungen von Oxidase-Präparationen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung oder gebundenem Antikörper konnte gezeigt werden, dass die Biphasizität der Oxidase-Kinetik ! nicht auf der Anwesenheit der Untereinheiten III und IV beruht, ! durch die spezifische Bindung von Antikörpern zu niedrigeren Ionenstärken verschoben wird bei gleichzeitiger Verringerung der Affinität zum Substrat, ! eine intrinsische Eigenschaft aller untersuchten Mutanten ist. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnten keine Hinweise auf eine zweite Cytochrom c Bindungsstelle gefunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Expression, Reinigung und Charakterisierung des homologe, membrangebundenen Cytochrom c552 aus P. denitrificans. Das Protein wurde mit einem Histidin-Tag versehen und heterolog in E. coli in guter Ausbeute exprimiert und gereinigt. Seine Charakterisierung über steady-state-Messungen ergab ein deutlich verschobenes pH-Optimum mit höherer Affinität zur Oxidase im Vergleich zu seinen verkürzten löslichen Fragmenten.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
Hemoproteinoids related to contemporary porphyrin-dependent peroxidases were synthesized under simple conditions. The peroxidative activity of hematin increased by a factor of 50 if the hematin was bound to proteinoids whereas the catalatic activity of hematin decreased rather under the same conditions. The peroxidative activity of hemoproteinoids particularly increased with their lysine content whereas the catalatic activity especially decreased in proteinoids with high phenylalanine content. The isoelectric points of the lysine-rich peroxidic hemoproteinoids were about 8. Their relatively broad pH-activity optimum was about pH 7.0. The molecular weights were a little below 20 000. Hematin content and amino acid composition of the synthetic materials were varied greatly. The substrate specificity appeared as broad as that of biogenous peroxidases, e. g., horseradish peroxidase. Among the many substrates was NADH. The possible importance of the peroxidative oxidation of NADH-type coenzymes by primitive heterotrophic organisms or prebiological systems in an anaerobic environment is discussed.
The formation of aliphatic α-amino acids by X-ray induced carboxylation of simple amines or amination of simple carboxylic acids is not favored over the formation of other amino acids. The new carboxylic and amino groups are more or less distributed statistically over the carbon atoms of the starting material. On radiationchemical formation of aliphatic hydrocarbons over C3, therefore, an increasing amount of unusual amino acids is produced. The results are influenced by various parameters such as temperature, pH, concentration, linear energy transfer and total dosis of radiation applied. Also peptides can be formed radiationchemically. However, the formation of greater molecules by radiationchemical processes under the conditions of a primitive earth seems to have only a low probability. The reaction mechanisms of radiationchemical carboxylation and amination are discussed.
The title compound, [Fe2(C5H5)2(C24H22BP2)(CO)4][FeCl4]·CHCl3, is an oxidation product of CpFe(CO)2PPh2BH3. One pair of phenyl rings attached to the two different P atoms are almost parallel, as are the other pair [dihedral angles = 8.7 (5) and 8.9 (5)°]. The planes of the two cyclopentadienyl rings are inclined by 26.8 (7)° with respect to each other. The carbonyl groups at each Fe atom are almost perpendicular [C-Fe-C = 92.6 (6) and 94.3 (5)°]. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 173 K; mean σ(C–C) = 0.019 Å; R factor = 0.112; wR factor = 0.177; data-to-parameter ratio = 16.8.
The geometric parameters of the molecule of the title compound, C14H16O2P2, are in the usual ranges. It is a meso compound with the two chiral P atoms having opposite configurations. The P-CH2-CH2-P chain adopts a trans conformation [torsion angle -178.59 (17)°]. The P=O bonds are almost coplanar with the adjacent phenyl ring [torsion angles = 3.8 (3) and 0.3 (3)°]. Whereas one of them is synclinal [torsion angle = -59.0 (2)°] to the central C-C bond, the other is anticlinal [torsion angle = 56.6 (2)°] to the central C-C bond. The dihedral angle between the two phenyl rings is 5.2 (3)°. The molecules are linked by weak C-H...O hydrogen bonds. They crystallize in rows running along the c axis. Key indicators: single-crystal X-ray study; T = 173 K; mean σ(C–C) = 0.005 Å; R factor = 0.038; wR factor = 0.093; data-to-parameter ratio = 15.2.
Decades of work have demonstrated that mRNAs are localized and translated within neuronal dendrites and axons to provide proteins for remodeling and maintaining growth cones or synapses. It remains unknown, however, whether specific forms of plasticity differentially regulate the dynamics and translation of individual mRNA species. To address these issues, we targeted three individual synaptically-localized mRNAs, CamkIIa, Beta actin, Psd95, and used molecular beacons to track endogenous mRNA movements and reporters and Crispr-Cas9 gene editing to track their translation. We found widespread alterations in mRNA behavior during two forms of synaptic plasticity, long-term potentiation (LTP) and depression (LTD). Changes in mRNA dynamics following plasticity resulted in an enrichment of mRNA in the vicinity of dendritic spines. Both the reporters and tagging of endogenous proteins revealed the transcript-specific stimulation of protein synthesis following LTP or LTD. The plasticity-induced enrichment of mRNA near synapses could be uncoupled from its translational status. The enrichment of mRNA in the proximity of spines allows for localized signaling pathways to decode plasticity milieus and stimulate a specific translational profile, resulting in a customized remodeling of the synaptic proteome.
Decades of work have demonstrated that messenger RNAs (mRNAs) are localized and translated within neuronal dendrites and axons to provide proteins for remodeling and maintaining growth cones or synapses. It remains unknown, however, whether specific forms of plasticity differentially regulate the dynamics and translation of individual mRNA species. To address this, we targeted three individual synaptically localized mRNAs, CamkIIa, β-actin, Psd95, and used molecular beacons to track endogenous mRNA movements. We used reporters and CRISPR/Cas9 gene editing to track mRNA translation in cultured neurons. We found alterations in mRNA dynamic properties occurred during two forms of synaptic plasticity, long-term potentiation (cLTP) and depression (mGluR-LTD). Changes in mRNA dynamics following either form of plasticity resulted in an enrichment of mRNA in the vicinity of dendritic spines. Both the reporters and tagging of endogenous proteins revealed the transcript-specific stimulation of protein synthesis following cLTP or mGluR-LTD. As such, the plasticity-induced enrichment of mRNA near synapses could be uncoupled from its translational status. The enrichment of mRNA in the proximity of spines allows for localized signaling pathways to decode plasticity milieus and stimulate a specific translational profile, resulting in a customized remodeling of the synaptic proteome.
Studies over the past decade have revealed that metabolism profoundly influences immune responses. In particular, metabolism causes epigenetic regulation of gene expression, as a growing number of metabolic intermediates are substrates for histone post-translational modifications altering chromatin structure. One of these substrates is acetyl-coenzyme A (CoA), which donates an acetyl group for histone acetylation. Cytosolic acetyl-CoA is also a critical substrate for de novo synthesis of fatty acids and sterols necessary for rapid cellular growth. One of the main enzymes catalyzing cytosolic acetyl-CoA formation is ATP-citrate lyase (ACLY). In addition to its classical function in the provision of acetyl-CoA for de novo lipogenesis, ACLY contributes to epigenetic regulation through histone acetylation, which is increasingly appreciated. In this review we explore the current knowledge of ACLY and acetyl-CoA in mediating innate and adaptive immune responses. We focus on the role of ACLY in supporting de novo lipogenesis in immune cells as well as on its impact on epigenetic alterations. Moreover, we summarize alternative sources of acetyl-CoA and their contribution to metabolic and epigenetic regulation in cells of the immune system.
In der Arbeit wurden neue Komplexbildner für die nasschemische, alkalische Reinigung von Siliciumhalbleiteroberflächen vorgestellt. Dabei handelte es sich neben kommerziell verfügbaren Verbindungen, wie beispielsweise Tiron, um den Chelatbildner Pyrinan und die vielversprechende Gruppe der 3-Hydroxypyridin-4(1H)-on-Komplexbildner („Pyridinone“). Insbesondere Letztere sind als effiziente Eisenkomplexbildner von präklinischen Untersuchungen zur Therapie von Eisenstoffwechselerkrankungen bekannt und haben deshalb großes Interesse hervorgerufen. Die Darstellung von Pyrinan und der Pyridinone war in befriedigenden bis guten Ausbeuten mit herkömmlichen Syntheseschritten möglich. Die Synthese konnte somit die im Abschnitt 1.2.1 erwähnten Anforderungen an die Komplexbildner befriedigen. Hinsichtlich der an die Strukturierung von Halbleitermaterialen geknüpften, jedoch bei der Präparation der Komplexbildner nicht realisierten Reinheitsbedingungen, wiesen diese einen teilweise erheblichen Kontaminationsgrad durch Metalle auf. Demzufolge hätten die Komplexbildner als potentielle Kontaminationsquellen bei der SC1-Reinigung von Siliciumsubstraten wirken können. Letzteres konnte jedoch im Rahmen der zehnminütigen Immersionsdauer in ¼/20 SC1 bei 70 °C weitgehend ausgeschlossen werden. Der Trend bei der nasschemischen Reinigung von Halbleitersubstraten mit immer stärker verdünnten Reinigunslösungen und reduzierten Reinigungsbadtemperaturen zu arbeiten, sollten dieses und die folgend zusammengefassten Ergebnisse noch weiter begünstigen. Es wurden Reinigungsexperimente mit Siliciumsubstraten und mit den Reinigungslösungen absichtlich zugesetzten Kontaminanten durchgeführt, um die Wirkungen der einzelnen Verbindungen besser studieren zu können. Es wurden die Metalle Al, Fe, Zn, Cu, Ni und Cr, die in der Halbleiterproduktion als gängige Kontaminanten auftreten, untersucht. Die Metalle Zn, Ni und Cu spielen in der SC1-Lösung, mit abnehmender Gewichtung in der genannten Reihenfolge, aufgrund deren Amminkomplexbildung keine nennenswerten Rolle als Oberflächenkontaminanten. Cr(III) wird in der SC1-Lösung zu Chromat oxidiert und kontaminiert aus diesem Grund die Oberfläche ebenfalls nicht. Dem gegenüber sind Al und Fe unter den gewählten Bedingungen sehr starke Oberflächenkontaminanten. Prinzipiell eignen sich fast alle untersuchten Komplexbildner, die Siliciumoberfläche vor der Kontamination durch Fe aus SC1 zu schützen. Hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gegenüber Al und Zn wurden sie jedoch deutlich diskriminiert. Daraus schlussfolgernd ist der Einsatz mehrerer Komplexbildnern erforderlich, um die Kontaminationsgefahr der Siliciumoberfläche durch alle genannten Metalle gezielt kontrollieren und über einen gewissen Schwellenwert vermeiden zu können. Die Wirkung von Pyrinan und der Pyridinone ist vergleichbar, meistens jedoch deutlich besser, als die herkömmlicher Poly(alpha-aminomethylencarbonsäuren) (z. B. EDTA, Untersuchungen von IMEC). Sie erzielen Oberflächenkonzentrationen kritischer Kontaminanten (z. B. Fe) in der Größenordnung, die für die Prozessierung aktueller und künftiger Generationen von Bauelementen erforderlich sind. Konsequenterweise sind deshalb sowohl Pyrinan als auch die Pyridinonkomplexbildner und deren Verwendungszweck zum Patent angemeldet worden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Eignung der Komplexbildner bestimmt, hochkonzentrierte, den Halbleiterspezifikationen entsprechende Lösungen von H2O2 stabilisieren zu können. Die Stabilität wurde in Abhängigkeit von drei vorgegebenen Lagerungstemperaturen verfolgt. Sowohl die vorgestellten Verbindungen als auch die als Referenzsubstanz mituntersuchte Verbindung Dequest® 2060s konnten die an einen geeigneten Stabilisator gestellten Bedingungen nicht befriedigen. Lediglich die nicht stabilisierte Lösung von H2O2, die Referenzprobe, besaß eine, über den gesamten Beobachtungszeitraum ausreichende Stabilität. Das mangelhafte Abschneiden der vorgestellten Verbindungen als potentielle Stabilisatoren wird deren partieller bzw. vollständiger Oxidation durch H2O2 zugeordnet und ist am Beispiel von Dequest® 2060s weiter diskutiert worden. Im Zuge der Oxidation werden die intrinsischen Metallkontaminationen der Komplexbildner freigesetzt, wodurch die Kontaminanten in die Lage versetzt werden können, in das Reaktionsgeschehen katalytisch einzugreifen und die Zersetzung der Proben zu beschleunigen. Die Lagerung der Komplexbildner in konzentriertem NH3 stellt die Alternative zur Lagerung in H2O2 dar, wenn man zu einem fertig einsetzbaren, industriellen Produkt für die nasschemische Reinigung von Halbleiteroberflächen gelangen möchte, welches eine einstufige alkalische Reinigung (APM+®) ermöglicht. Hier konnten bis auf die Proben, welche Tiron als Komplexbildner enthielten, keine Besonderheiten festgestellt werden. Die mit Tiron versetzten Proben führen bereits nach sehr kurzer Lagerungsdauer zu einer intensiv rot gefärbten Lösung, die der im Alkalischen und durch Luftsauerstoff erfolgenden Oxidation von Tiron durch Luftsauerstoff zugerechnet wird. Eine, die Reinigungsexperimente ergänzende und wichtige Information, stellt die Stabilität der Komplexbildner und durch diese bedingt die der gesamten Reinigungslösung dar. Letztere wurde durch die titrimetrische Bestimmung der Konzentration von H2O2 ausgesuchter Reinigungslösungen bestimmt. Die Stabilität des Komplexbildners DEHP wurde stellvertretend für die ganze Gruppe (der einfachen Pyridinone) in verschiedenen, in der Halbleiterfertigung üblichen, alkalischen, H2O2 enthaltenden Reinigungslösungen untersucht. Die Stabilitätsbestimmungen von DEHP, ausgedrückt in Form dessen Halbwertszeit der Zersetzung in den Reinigungslösungen, wurden mit Hilfe der UV/Vis-Spektralphotometrie durchgeführt. Im Zuge der Stabilitätsbestimmungen wurde festgestellt, dass der Komplexbildner DEHP die Reinigungslösungen zwischen drei (im Fall von 1,65/1/5 TPM) bis vier (im Fall von ¼/20 SC1 und von 1,65/1/5 NC) Halbwertszeiten zu stabilisieren vermag. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass DEHP die niedrigste Halbwertszeit in Reinigungslösungen mit TMAH als Base und die höchste in solchen mit Cholin besitzt. Die in den ¼/20-SC1-Lösungen, also mit NH3 als Base, nimmt die mittlere Stellung der drei untersuchten Typen von Reinigungslösungen ein. Diese Abstufung der Stabilitäten wird einerseits dem individuellen komplexierenden Potential der einzelnen Basen als auch der von Cholin vermuteten Rolle, in der Reinigungslösung als Opferreduktionsmittel zu wirken und damit die Lebensdauer (Halbwertszeit) des Komplexbildners zu fördern, zugeordnet. Die UV/Vis-Spektralphotometrie hat sich darüber hinaus bei den Untersuchungen als einfach handhabbares und möglicherweise auch leicht automatisierbares Quantifizierungsverfahren zur Implementierung in bereits bestehende Reinigungsanlagen erwiesen.
Folding of RNA molecules into their functional three-dimensional structures is often supported by RNA chaperones, some of which can catalyse the two elementary reactions helix disruption and helix formation. Hfq is one such RNA chaperone, but its strand displacement activity is controversial. Whereas some groups found Hfq to destabilize secondary structures, others did not observe such an activity with their RNA substrates. We studied Hfq’s activities using a set of short RNAs of different thermodynamic stabilities (GC-contents from 4.8% to 61.9%), but constant length. We show that Hfq’s strand displacement as well as its annealing activity are strongly dependent on the substrate’s GC-content. However, this is due to Hfq’s preferred binding of AU-rich sequences and not to the substrate’s thermodynamic stability. Importantly, Hfq catalyses both annealing and strand displacement with comparable rates for different substrates, hinting at RNA strand diffusion and annealing nucleation being rate-limiting for both reactions. Hfq’s strand displacement activity is a result of the thermodynamic destabilization of the RNA through preferred single-strand binding whereas annealing acceleration is independent from Hfq’s thermodynamic influence. Therefore, the two apparently disparate activities annealing acceleration and duplex destabilization are not in energetic conflict with each other.
Transmetallation and oxidative substitution were utilized to prepare examples of group 14, group 6 and group 10 complexes from lithiated or chlorinated 4,4-dimethyl-2-(2-thienyl) oxazoline or its N-alkylated analogs. Two of the product types (2and 5) can be classified as a-thio or remote carbene complexes, depending on the position (3- or 5-) of attachment to the substituted thiophene ring. Spectroscopic measurements as well as crystal and molecular structure determinations clarified the bonding within the new compounds.
The nicotinamide-adenine-dinucleotide (NADH):ubiquinone oxidoreductase (complex I) from the strictly aerobic yeast Y. lipolytica contains at least 26 “accessory” subunits however the significance of most of them remains unknown. The aim of this study was to characterize the role of three accessory subunits of complex I, recently identified: two mitochondrial acyl carrier proteins, ACPM1 and ACPM2 and a sulfurtransferase (st1) subunit. ACPMs are small (approx. 10 kDa) acidic proteins that are homologous to the corresponding central components of prokaryotic fatty acid synthase complexes. Genomic deletions of the two genes ACPM1 and ACPM2 resulted in strains that were not viable or retained only trace amounts of assembled mitochondrial complex I, respectively, as assessed using two-dimensional blue native/sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (BN/SDS) PAGE. This suggested different functions for the two proteins that despite high similarity could not be complemented by the respective other homolog still expressed in the deletion strains. To test whether complex I was affected by deletion of the ACPM2 gene, its activities in mitochondrial membranes were measured. Consequently, specific inhibitor sensitive dNADH: decylubiquinone (DBQ) oxidoreductase activity was lost completely and a strong decrease in dNADH: hexa-ammine-ruthenium (HAR) oxidoreductase activity was measured. Remarkably, the same phenotypes were observed if just the conserved serine carrying the phosphopantethein moiety was exchanged with alanine. Although this suggested a functional link to the lipid metabolism of mitochondria, using HPLC chromatography no changes in the lipid composition of the organelles were found. Proteomic analysis revealed that both ACPMs were tightly bound to purified mitochondrial complex I. Western blot analysis revealed that the affinity tagged ACPM1 and ACPM2 proteins were exclusively detectable in mitochondrial membranes but not in the mitochondrial matrix as reported for other organisms. Hence it has been concluded that the ACPMs can serve all their possible functions in mitochondrial lipid metabolism and complex I assembly and stabilization as subunits bound to complex I. A protein exhibiting rhodanese (thiosulfate:cyanide sulfurtransferase) activity was found to be associated with homogenous preparation of complex I. From a rhodanese deletion strain, functional complex I that lacked the additional protein but was fully assembled and displayed no functional defects or changes in EPR signature was purified. In contrast to previous suggestions, this indicated that the sulfurtransferase associated with Y. lipolytica complex I is not required for assembly of its iron–sulfur clusters.
Amorphous formulation technologies to improve oral absorption of poorly soluble active pharmaceutical ingredients (APIs) have become increasingly prevalent. Currently, polymer-based amorphous formulations manufactured by spray drying, hot melt extrusion (HME), or co-precipitation are most common. However, these technologies have challenges in terms of the successful stabilization of poor glass former compounds in the amorphous form. An alternative approach is mesoporous silica, which stabilizes APIs in non-crystalline form via molecular adsorption inside nano-scale pores. In line with these considerations, two poor glass formers, haloperidol and carbamazepine, were formulated as polymer-based solid dispersion via HME and with mesoporous silica, and their stability was compared under accelerated conditions. Changes were monitored over three months with respect to solid-state form and dissolution. The results were supported by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (SS-NMR) and scanning electron microscopy (SEM). It was demonstrated that mesoporous silica was more successful than HME in the stabilization of the selected poor glass formers. While both drugs remained non-crystalline during the study using mesoporous silica, polymer-based HME formulations showed recrystallization after one week. Thus, mesoporous silica represents an attractive technology to extend the formulation toolbox to poorly soluble poor glass formers.
Ion channel gating is essential for cellular homeostasis and is tightly controlled. In some eukaryotic and most bacterial ligand-gated K+ channels, RCK domains regulate ion fluxes. Until now, a single regulatory mechanism has been proposed for all RCK-regulated channels, involving signal transduction from the RCK domain to the gating area. Here, we present an inactive ADP-bound structure of KtrAB from Vibrio alginolyticus, determined by cryo-electron microscopy, which, combined with EPR spectroscopy and molecular dynamics simulations, uncovers a novel regulatory mechanism for ligand-induced action at a distance. Exchange of activating ATP to inactivating ADP triggers short helical segments in the K+-translocating KtrB dimer to organize into two long helices that penetrate deeply into the regulatory RCK domains, thus connecting nucleotide-binding sites and ion gates. As KtrAB and its homolog TrkAH have been implicated as bacterial pathogenicity factors, the discovery of this functionally relevant inactive conformation may advance structure-guided drug development.
Advanced colorectal carcinoma is currently incurable, and new therapies are urgently needed. We report that phosphotyrosine-dependent Eph receptor signaling sustains colorectal carcinoma cell survival, thereby uncovering a survival pathway active in colorectal carcinoma cells. We find that genetic and biochemical inhibition of Eph tyrosine kinase activity or depletion of the Eph ligand EphrinB2 reproducibly induces colorectal carcinoma cell death by autophagy. Spautin and 3-methyladenine, inhibitors of early steps in the autophagic pathway, significantly reduce autophagy-mediated cell death that follows inhibition of phosphotyrosine-dependent Eph signaling in colorectal cancer cells. A small-molecule inhibitor of the Eph kinase, NVP-BHG712 or its regioisomer NVP-Iso, reduces human colorectal cancer cell growth in vitro and tumor growth in mice. Colorectal cancers express the EphrinB ligand and its Eph receptors at significantly higher levels than numerous other cancer types, supporting Eph signaling inhibition as a potential new strategy for the broad treatment of colorectal carcinoma.
The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
Seit langem gibt es ein großes Interesse daran, den zeitlichen Ablauf von chemischen Reaktionen zu untersuchen. Ein wichtiges Instrument hierfür ist die Kurzzeitspektroskopie, die in jüngerer Vergangenheit parallel zum rasanten technischen Fortschritt mit immer kürzeren Laserpulsen bis hinein in den Femtosekunden-Bereich einen neuen Boom erlebt hat. Durch die extrem hohe Zeitauflösung ist es heutzutage möglich geworden, die Reaktionsdynamik eines Moleküls quasi in Echtzeit zu verfolgen, weil man durch die Femtosekunden-Pulse die Bewegung der Atomkerne wie mit einer schnellen Kamera beobachten kann. Mit wachsender Anzahl der Experimente gibt es gleichzeitig einen steigenden Bedarf, die Vielzahl der gemessenen und in vielen Aspekten noch unverstandenen Signale auf mikroskopischer Ebene theoretisch zu beschreiben und zu erklären. Besonders interessant dabei ist, dass dies u.a. für komplexe Systeme möglich wird, weil auf den extrem kurzen Zeitskalen auch in sehr großen Molekülen nur einige wenige Freiheitsgrade eine Rolle spielen. Thema dieser Arbeit war die überwiegend klassische Modellierung von nicht-adiabatischer Kurzzeitdynamik in molekularen Quantensystemen, deren Beschreibung über die Born-Oppenheimer-Näherung hinausgeht. Dabei wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit neue Methoden und Rechenverfahren entwickelt, die einerseits eine verbesserte. physikalisch intuitive Anschauung vermitteln und andererseits aufgrund geeigneter Näherungen deutlich Rechenzeit einsparen und dadurch den Zugang zu Modellen größerer Moleküle ermöglichen können. Zunächst wurde die Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren mit Hilfe der Franck-Condon-Approximation durchgeführt, bei der die nukleare. Dynamik während des Laserpulses vernachlässigt wird. Diese bekannte Näherung konnte im Rahmen der Arbeit erstmals auf nichtadiabatisch gekoppelte Potentialflächen angewandt werden. Anschließend wurde für das interessierende Quantensystem mit Hilfe des Mapping-Formalismus ein klassisches Analogon eingeführt und dessen Dynamik eingehend studiert. Dies ist deshalb bemerkenswert, weil dadurch erstmals eine Anwendung von klassischen Methoden aus dem Bereich der nichtlinearen Dvnamik auf nichtadiabatische Quantensvsteme möglich wurde. Schließlich konnten klassische periodische Bahnen des Systems identifiziert werden. Dabei handelte es sich im hier betrachteten Fall nichtadiabatisch gekoppelter Potentiale um eine völlig neue Art von vibronischen periodischen Orbits, die sowohl aus einem nuklearen als auch einem elektronischen Freiheitsgrad bestehen. Dadurch konnte in einem nächsten Schritt mit Hilfe einiger weniger Orbits die Kurzzeitdynamik des Systems modelliert werden. Den Schlusspunkt dieser Untersuchungen bildete die klassische Simulation von zeitaufgelösten Pump-Probe-Spektren. Nachdem diese neue Methode mit periodischen Orbits an einem einfachen, stark idealisierten Modell erfolgreich getestet werden konnte, stellte sich jedoch schnell heraus, dass es in mehrdimensionalen Modellen mit einer Torsionsmode zur Beschreibung von Photoisomerisierungs-Prozessen nicht mehr so leicht möglich ist, solche einfachen periodischen Bahnen zu finden, weil die Zeitskalen von nuklearer und elektronischer Bewegung in diesen Systemen sehr unterschiedlich sind. Es ist deshalb in diesem Fall sinnvoll, das Konzept periodischer Orbits dahingehend zu erweitern, die klassische Dynamik in unterschiedliche allgemeine Bewegungstypen einzuteilen, die dann zur Interpretation von quantenmechanischen Ergebnissen herangezogen werden können. Dies stellt eine neue Möglichkeit dar, die komplizierte Wellenpaketdynamik auf physikalisch intuitive Weise zu veranschaulichen. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Arbeit Beiträge für das Verständnis nichtadiabatischer Quantendynamik liefert: Zum einen werden Fragestellungen von prinzipiellem Interesse diskutiert, wie z.B. der klassische Limes von Quantensystemen insbesondere bei chaotischem Verhalten, zum anderen werden durch die Anwendung von Analyseverfahren der klassischen nichtlinearen Dynamik auf vibronisch gekoppelte Molekülmodelle neue Gebiete erschlossen, die ein verbessertes theoretisches Verständnis experimenteller Ergebnisse im Bereich der Kurzzeitspektroskopie ermöglichen.
Background: The human receptor tyrosine kinase MET and its ligand hepatocyte growth factor/scatter factor are essential during embryonic development and play an important role during cancer metastasis and tissue regeneration. In addition, it was found that MET is also relevant for infectious diseases and is the target of different bacteria, amongst them Listeria monocytogenes that induces bacterial uptake through the surface protein internalin B. Binding of ligand to the MET receptor is proposed to lead to receptor dimerization. However, it is also discussed whether preformed MET dimers exist on the cell membrane.
Results: To address these issues we used single-molecule fluorescence microscopy techniques. Our photobleaching experiments show that MET exists in dimers on the membrane of cells in the absence of ligand and that the proportion of MET dimers increases significantly upon ligand binding.
Conclusions: Our results indicate that partially preformed MET dimers may play a role in ligand binding or MET signaling. The addition of the bacterial ligand internalin B leads to an increase of MET dimers which is in agreement with the model of ligand-induced dimerization of receptor tyrosine kinases.
Oral presentations Background: We selected peptide ligands for the HIV-1 packaging signal PSI by screening phage displayed peptide libraries. Peptide ligands were optimized by screening spot synthesis peptide membranes. The aim of this study is the functional characterization of these peptide ligands with respect to inhibition of HIV-1 replication. Methods: Phage displayed peptide libraries were screened with PSI-RNA structures. The Trp-rich peptide motifs were optimized for specific binding on spot synthesis peptide membranes. The best binding peptide was expressed intracellularly in fusion with RFP or linked to a protein transduction domain (PTD) for intracellular delivery. The effects on virion production were analyzed using pseudotyped lentiviral particles. Results: After positive and negative selection rounds, phages binding specifically to PSI-RNA were identified by ELISA. Peptide inserts contained conserved motifs of aromatic amino acids known to be implicated in binding of PSI-RNA by the natural Gag ligand. The filter assay identified HKWPWW as the best binding ligand for PSI-RNA, which is delivered into several cell lines by addition of a PTD. Compared to a control peptide, the HKWPWW peptide inhibited HIV-1 replication as deduced from reduced titers of culture supernatants. As HKWPWW also binds to the TAR-RNA like the natural nucleocapsid PSI-RNA ligand, the effect on Tat-TAR inhibition will also be analyzed. Currently T-cell lines are established which stably express HKWPWW as well as a control peptide, which will be infected with HIV-1 to monitor the ability of HKWPWW to inhibit wild type HIV-1 replication. Conclusion: The selection of a peptide ligand for PSI-RNA able to inhibit HIV-1 replication proves the suitability of the phage display technology for the selection of peptides binding to RNA-structures. This enables the indentification of peptides serving as leads to interfere with additional targets in the HIV-1 replication cycle.
The NAD analogue [3-(3-acetylpyridinio)-propyl] adenosine pyrophosphate forms enzymically inactive complexes with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast and rabbit skeletal muscle. In the latter enzyme four mol of the analogue are bound with equal affinity inhibiting the enzyme in a competitive way: KI = 0.3 mM as compared to the dissociation constant KD=O.6 mм.
The brominated derivative [3- (3-bromoacetylpyridinio) -propyl] adenosine pyrophosphate is covalently bound to both enzymes causing irreversible loss of enzymic activity. Complete inactivation of the enzyme from muscle requires two moles of the analogue per mol of tetramer. The remaining two sites are still able to bind two mol of NAD+ without regain of enzymic activity. In the case of the yeast enzyme four mol of the analogue are bound. Inactivation of the rabbit muscle enzyme is accompanied by the disappearance of two out of four highly reactive sulfhydryl groups; in the yeast enzyme the four active site cysteine residues are still able to react with DTNB1 the reactivity being diminished significantly.
Hybrid formation between the native enzymes from yeast and skeletal muscle is not affected by the modification of the enzyme. Similarly the sedimentation properties of the covalently modified enzyme are indistinguishable from those of the native molecule. This indicates that both the native and the irreversibly inhibited enzyme are identical regarding their quaternary structure.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der π-Elektronensysteme [Pi-Elektronensysteme]
(1963)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme Hückel entwickelte 1931 ein Verfahren zur quantenmechanischen Berechnung zahlreicher Eigenschaften von zr-Elektronensystemen. Obwohl die Theorie halbtheoretisch ist, hat sie einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis solcher Eigenschaften von ungesättigten und aromatischen Verbindungen geliefert, die dem Grundzustand der Moleküle zugeschrieben werden können, so z. B. der Resonanzstabilität und der Reaktivität. Doch ist sie nur in der Lage, die Eigenschaften dieser Verbindungen richtig zu beschreiben, die durch angeregte Zustände der Moleküle mitbestimmt werden, wie z. B. die Spektren, wenn man für das Resononanzintegral einen entsprechenden Wert verwendet, der von dem für den Grundzustand benutzten bedeutend abweichen kan. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird die Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme diskutiert. Einen nur annähernd vollständigen Überblick über die Beiträge zu dieser Theorie zu geben, würde den Rahmen der Arbeit überschreiten. Daher wurde sich im Wesentlichen darauf beschänkt, die Grundgedanken und die Näherungen des Verfahrens klar darzustellen und kritisch zu betrachten, sowie die Anwendungsmöglicheiten zu beschreiben. Hartmann hat 1960 eine Erweiterung der Hückel 'schen Theorie vorgeschlagen, die auch solche Eigenschaften ungesättigter und aromatischer Verbindunsen richtig erfaßt, die aur der Beteiligung angeregter Zustände beruhen, wie am Beispiel der Spektren gezeigt wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Hückel-Hartmann'sche Theorie der Pi-Elektronensysteme dargestellt und die Ergebnisse mit denen der Hückel'schen Theorie verglichen. Hartmann selbst hat die Erweiterung nur für gleichatomige Pi-Elektronensysteme und unter zahlreichen Vernachlässigunen durchgeführt. Dieser Umstand und die wenigen zu der Theorie erst vorliegenden Arbeiten ließen es wünschensert erscheinen, die Hückel-Hartmannsche Theorie der Pi-Elektronensysteme systematisch und in möglichst allgemeiner Form zu diskutieren. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird daher eine Generalisierung der Hückel-Hartmannt'schen Theorie durchgeführt. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens wird anschließend der Einfluß der Überlappungen auf die Ergebnisse untersucht und eine Erweiterung der Hückel-Hartmann'schen Theorie auf heteroatomare Pi-Elektronensysteme angegeben.
Imaging non-adherent cells by super-resolution far-field fluorescence microscopy is currently not possible because of their rapid movement while in suspension. Holographic optical tweezers (HOTs) enable the ability to freely control the number and position of optical traps, thus facilitating the unrestricted manipulation of cells in a volume around the focal plane. Here we show that immobilizing non-adherent cells by optical tweezers is sufficient to achieve optical resolution well below the diffraction limit using localization microscopy. Individual cells can be oriented arbitrarily but preferably either horizontally or vertically relative to the microscope’s image plane, enabling access to sample sections that are impossible to achieve with conventional sample preparation and immobilization. This opens up new opportunities to super-resolve the nanoscale organization of chromosomal DNA in individual bacterial cells.
Membrane-suspended nanopores in microchip arrays for stochastic transport recording and sensing
(2021)
The transport of nutrients, xenobiotics, and signaling molecules across biological membranes is essential for life. As gatekeepers of cells, membrane proteins and nanopores are key targets in pharmaceutical research and industry. Multiple techniques help in elucidating, utilizing, or mimicking the function of biological membrane-embedded nanodevices. In particular, the use of DNA origami to construct simple nanopores based on the predictable folding of nucleotides provides a promising direction for innovative sensing and sequencing approaches. Knowledge of translocation characteristics is crucial to link structural design with function. Here, we summarize recent developments and compare features of membrane-embedded nanopores with solid-state analogues. We also describe how their translocation properties are characterized by microchip systems. The recently developed silicon chips, comprising solid-state nanopores of 80 nm connecting femtoliter cavities in combination with vesicle spreading and formation of nanopore-suspended membranes, will pave the way to characterize translocation properties of nanopores and membrane proteins in high-throughput and at single-transporter resolution.
Nanopores are key in portable sequencing and research given their ability to transport elongated DNA or small bioactive molecules through narrow transmembrane channels. Transport of folded proteins could lead to similar scientific and technological benefits. Yet this has not been realised due to the shortage of wide and structurally defined natural pores. Here we report that a synthetic nanopore designed via DNA nanotechnology can accommodate folded proteins. Transport of fluorescent proteins through single pores is kinetically analysed using massively parallel optical readout with transparent silicon-on-insulator cavity chips vs. electrical recordings to reveal an at least 20-fold higher speed for the electrically driven movement. Pores nevertheless allow a high diffusive flux of more than 66 molecules per second that can also be directed beyond equillibria. The pores may be exploited to sense diagnostically relevant proteins with portable analysis technology, to create molecular gates for drug delivery, or to build synthetic cells.
HUWE1 E3 ligase promotes PINK1/PARKIN-independent mitophagy by regulating AMBRA1 activation via IKKα
(2018)
The selective removal of undesired or damaged mitochondria by autophagy, known as mitophagy, is crucial for cellular homoeostasis, and prevents tumour diffusion, neurodegeneration and ageing. The pro-autophagic molecule AMBRA1 (autophagy/beclin-1 regulator-1) has been defined as a novel regulator of mitophagy in both PINK1/PARKIN-dependent and -independent systems. Here, we identified the E3 ubiquitin ligase HUWE1 as a key inducing factor in AMBRA1-mediated mitophagy, a process that takes place independently of the main mitophagy receptors. Furthermore, we show that mitophagy function of AMBRA1 is post-translationally controlled, upon HUWE1 activity, by a positive phosphorylation on its serine 1014. This modification is mediated by the IKKα kinase and induces structural changes in AMBRA1, thus promoting its interaction with LC3/GABARAP (mATG8) proteins and its mitophagic activity. Altogether, these results demonstrate that AMBRA1 regulates mitophagy through a novel pathway, in which HUWE1 and IKKα are key factors, shedding new lights on the regulation of mitochondrial quality control and homoeostasis in mammalian cells.
DNA damage in oocytes induces a switch of the quality control factor TAp63α from dimer to tetramer
(2011)
TAp63a, a homolog of the p53 tumor suppressor, is a quality control factor in the female germline. Remarkably, already undamaged oocytes express high levels of the protein, suggesting that TAp63a’s activity is under tight control of an inhibitory mechanism. Biochemical studies have proposed that inhibition requires the C-terminal transactivation inhibitory domain. However, the structural mechanism of TAp63a inhibition remains unknown. Here, we show that TAp63a is kept in an inactive dimeric state. We reveal that relief of inhibition leads to tetramer formation with ~20-fold higher DNA affinity. In vivo, phosphorylation-triggered tetramerization of TAp63a is not reversible by dephosphorylation. Furthermore, we show that a helix in the oligomerization domain of p63 is crucial for tetramer stabilization and competes with the transactivation domain for the same binding site. Our results demonstrate how TAp63a is inhibited by complex domain-domain interactions that provide the basis for regulating quality control in oocytes.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Gel layers of crosslinked polyacrylamide with different porosities were synthesized and their properties compared. At high concentrations of bifunctional monomers macroporous gels were formed, one of which (total monomer concentration 14%, methylene-bis-acrylamide 40%) permitted even high molecular weight proteins (e. g. γ-globulins) to diffuse more readily than in 2 per cent agar or agarose gels. Different immunological techniques were modified for application with this polymer. It offers advantages especially with respect to porosity, storability and sample application for quantitative diffusion techniques.
Epidermal growth factor (EGF) receptor belongs to the broad family of enzymatic receptors called receptor tyrosine kinases (RTKs). Generally, the binding of a ligand to these receptors leads to activation of their intracellular kinase activity that sets in motion a cascade of signaling events. In order to ensure appropriate responses to physiological stimuli, the cell is endowed with the ability to regulate signal transduction via numerous mechanisms such as dephosphorylation of the RTK and its substrates as well as downregulation of the RTK. Activation of EGFR is a potent mitogenic (proliferative) and motogenic (cell motility) signal that plays crucial roles during embryonic development and maintenance of adult tissue. EGFR signaling is primarily regulated by ligand-induced receptor internalization with subsequent degradation in lysosomes. While the complex of proteins that are recruited to EGFR after its activation is well understood, proteins that interact with the receptor in the absence of ligand binding are still not systematically studied. With the goal of identifying novel binding partners of non-activated EGFR, a membrane based yeast-two hybrid screen (MYTH) was conducted. MYTH is based on the principle of in vivo reconstitution of the N-terminus (Nub) and C-terminus (Cub) halves of ubiquitin once brought into close proximity. A chimeric protein consisting of EGFR fused to Cub and a transcription factor was used as a bait to screen Nub-tagged cDNA library. Analysis of resultant yeast transformants revealed a total of 87 proteins to interact with EGFR. Of these only 11 were previously shown to bind to EGFR. A majority of the other proteins were shown to interact with the receptor by yeast retransformation. Fifteen were confirmed to bind to EGFR by coimmunoprecipitation assays in mammalian cells. One of the novel EGFR interactors identified in the screen was histone deacetylase 6 (HDAC6). This deacetylase is localized in the cytoplasm and known to deacetylate alpha-tubulin, HSP90 and cortactin. The juxtamembrane region of EGFR binds to the Cterminus of HDAC6. Functionally, overexpression of wild type HDAC6 stabilized ligand-induced degradation of the receptor. On the other hand, deacetylase deficient or EGFR binding compromised mutants of HDAC6 were able to stabilize EGFR only partially. Downmodulation of HDAC6 expression by RNAi markedly accelerated degradation of the receptor. Taken together, HDAC6 is a negative regulator of EGFR downregulation that is dependent on its deacetylase activity and ability to bind to the receptor. Imaging studies revealed that HDAC6 does not affect internalization of EGFR from the plasma membrane but rather influences the post-endocytic trafficking of the receptor-ligand complex to lysosomes. Pulse-chase experiments using fluorophoretagged EGF showed that EGFR is transported faster towards the peri-nuclear region and delivered to late endosomes rapidly in HDAC6 depleted cells. HDAC6 is demonstrated to act, at least partly, by regulating the acetylation of alpha-tubulin. Upon EGFR activation, acetylation of alpha-tubulin on lysine 40 is progressively increased as shown by mass spectrometry and immunoblotting. Forced expression of a dominant negative mutant of alpha-tubulin, but not wild type alpha-tubulin, led to reduced speed and processive movement of early endosomes in GFP-Rab5 expressing cells. In a surprising twist, EGFR is able to phosphorylate HDAC6 on Tyr570. Phosphorylation of Tyr570 and Ser568 leads to inactivation of the deacetylase function of HDAC6 as shown by in vivo and in vitro assays. In summary, HDAC6 diminishes EGFR downregulation by slowing the transport of intracellular vesicles. The inhibitory effect is removed once HDAC6 is phosphorylated on key residues. In line with these findings, two recent reports have shown that hyper-acetylation of alpha-tubulin induced by inhibition of HDAC6 increases the transport of brain derived neurotrophic factor and JNK interacting protein-1 in different cell systems. Acetylated microtubules are more efficient in recruiting motor proteins like kinesin-1 and dynein. These findings indicate that HDAC6 plays an important regulatory role in intracellular trafficking pathways. However, several outstanding issues still remain unresolved. How does acetylation of microtubules influence vesicular trafficking? In this regard, the temporal and spatial dynamics of alpha-tubulin acetylation following EGFR activation should be studied. Furthermore, whether HDAC6 affects the trafficking of other endocytic cargos and additional organelles is an interesting question to address.
Identification of a lysosomal peptide transport system induced during dendritic cell development
(2007)
The delivery of protein fragments to major histocompatibility complex (MHC)-loading compartments of professional antigen-presenting cells is essential in the adaptive immune response against pathogens. Apart from the crucial role of the transporter associated with antigen processing (TAP) for peptide loading of MHC class I molecules in the endoplasmic reticulum, TAP-independent translocation pathways have been proposed but not identified so far. Based on its overlapping substrate specificity with TAP, we herein investigated the ABC transporter ABCB9, also named TAP-like (TAPL). Remarkably, TAPL expression is strongly induced during differentiation of monocytes to dendritic cells and to macrophages. TAPL does not, however, restore MHC class I surface expression in TAP-deficient cells, demonstrating that TAPL alone or in combination with single TAP subunits does not form a functional transport complex required for peptide loading of MHC I in the endoplasmic reticulum. In fact, by using quantitative immunofluorescence and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome-associated membrane protein LAMP-2. By in vitro assays, we demonstrate a TAPL-specific translocation of peptides into isolated lysosomes, which strictly requires ATP hydrolysis. These results suggest a mechanism by which antigenic peptides have access to the lysosomal compartment in professional antigen-presenting cells.
ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
Nach Kultivierung von Enterococcus Stei mit 14C-markiertem 5-Chlor-, 5-Brom- oder 5-Jod-Uracil wurde aus den Zellen die DNS isoliert und hoch gereinigt. Durch UV-Bestrahlung dieser DNS in wäßriger Lösung werden die eingebauten 5-Halogen-Uracile photochemisch verändert. Beim Abbau dieser bestrahlten DNS findet man neben geringen Mengen nicht-identifizierter Photoprodukte als überwiegendes Strahlenprodukt nach Hydrolyse mit Perchlorsäure Uracil und nach fermentativem Abbau Uracildesoxyribosid. Die Dehalogenierung von BU und JU in der DNS verläuft in Abhängigkeit von der Bestrahlungsstärke etwa gleich schnell, während CU sehr viel langsamer dehalogeniert wird.
Die photochemische Dehalogenierung des BU erfolgt in der nativen DNS am leichtesten, weniger gut in der Hitze-denaturierten DNS und nur in geringem Maße in der Apurinsäure.
Glycol causes a denaturation of the DNA double helix structure in solution. As could be shown earlier, heat denaturation of DNA leads to an increased dimerization of thymine following uvirradiation. In contrast to this, thymine dimer is not increased - but is even slightly decreased - when DNA is uv-irradiated in the presence of glycol. These results are discussed with regard to the distortion of the hydration layer and the hydrophobic stacking of bases, as influenced by glycol.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
Runt-related transcription factor 1 (RUNX1) is a well-known master regulator of hematopoietic lineages but its mechanisms of action are still not fully understood. Here, we found that RUNX1 localizes on active chromatin together with Far Upstream Binding Protein 1 (FUBP1) in human B-cell precursor lymphoblasts, and that both factors interact in the same transcriptional regulatory complex. RUNX1 and FUBP1 chromatin localization identified c-KIT as a common target gene. We characterized two regulatory regions, at +700 bp and +30 kb within the first intron of c-KIT, bound by both RUNX1 and FUBP1, and that present active histone marks. Based on these regions, we proposed a novel FUBP1 FUSE-like DNA-binding sequence on the +30 kb enhancer. We demonstrated that FUBP1 and RUNX1 cooperate for the regulation of the expression of the oncogene c-KIT. Notably, upregulation of c-KIT expression by FUBP1 and RUNX1 promotes cell proliferation and renders cells more resistant to the c-KIT inhibitor imatinib mesylate, a common therapeutic drug. These results reveal a new mechanism of action of RUNX1 that implicates FUBP1, as a facilitator, to trigger transcriptional regulation of c-KIT and to regulate cell proliferation. Deregulation of this regulatory mechanism may explain some oncogenic function of RUNX1 and FUBP1.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
We used electron cryo-tomography and subtomogram averaging to investigate the structure of complex I and its supramolecular assemblies in the inner mitochondrial membrane of mammals, fungi, and plants. Tomographic volumes containing complex I were averaged at ∼4 nm resolution. Principal component analysis indicated that ∼60% of complex I formed a supercomplex with dimeric complex III, while ∼40% were not associated with other respiratory chain complexes. The mutual arrangement of complex I and III2 was essentially conserved in all supercomplexes investigated. In addition, up to two copies of monomeric complex IV were associated with the complex I1III2 assembly in bovine heart and the yeast Yarrowia lipolytica, but their positions varied. No complex IV was detected in the respiratory supercomplex of the plant Asparagus officinalis. Instead, an ∼4.5-nm globular protein density was observed on the matrix side of the complex I membrane arm, which we assign to γ-carbonic anhydrase. Our results demonstrate that respiratory chain supercomplexes in situ have a conserved core of complex I and III2, but otherwise their stoichiometry and structure varies. The conserved features of supercomplex assemblies indicate an important role in respiratory electron transfer.
Relative orientation of POTRA domains from cyanobacterial Omp85 studied by pulsed EPR spectroscopy
(2016)
Many proteins of the outer membrane of Gram-negative bacteria and of the outer envelope of the endosymbiotically derived organelles mitochondria and plastids have a β-barrel fold. Their insertion is assisted by membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily. These proteins are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. Based on structural studies of Omp85 proteins, including the five POTRA-domain-containing BamA protein of Escherichia coli, it is predicted that anaP2 and anaP3 bear a fixed orientation, whereas anaP1 and anaP2 are connected via a flexible hinge. We challenged this proposal by investigating the conformational space of the N-terminal POTRA domains of Omp85 from the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR, or DEER) spectroscopy. The pronounced dipolar oscillations observed for most of the double spin-labeled positions indicate a rather rigid orientation of the POTRA domains in frozen liquid solution. Based on the PELDOR distance data, structure refinement of the POTRA domains was performed taking two different approaches: 1) treating the individual POTRA domains as rigid bodies; and 2) using an all-atom refinement of the structure. Both refinement approaches yielded ensembles of model structures that are more restricted compared to the conformational ensemble obtained by molecular dynamics simulations, with only a slightly different orientation of N-terminal POTRA domains anaP1 and anaP2 compared with the x-ray structure. The results are discussed in the context of the native environment of the POTRA domains in the periplasm.
Pulsed electron–electron double resonance (PELDOR) spectroscopy is a powerful tool for measuring nanometer distances in spin-labeled systems and recently is increasingly applied to membrane proteins. However, after reconstitution of labeled proteins into liposomes, spin labels often exhibit a much faster transversal relaxation (Tm) than in detergent micelles, thus limiting application of the method in lipid bilayers. In the first part of the thesis, optimization of transversal relaxation in phospholipid membranes was systematically investigated by use of spin-labeled derivatives of stearic acid and phosphatidylcholine as well as spin-labeled derivatives of the channel-forming peptide gramicidin A under the conditions typically employed for PELDOR distance measurements. Our results clearly show that dephasing due to instantaneous diffusion that depends on dipolar interaction among electron spins is an important contributor to the fast echo decay in cases of high local concentrations of spin labels in membranes. The main difference between spin labels in detergent micelles and membranes is their local concentration. Consequently, avoiding spin aggregation and suppressing instantaneous diffusion is the key step for maximizing PELDOR sensitivity in lipid membranes. Even though proton spin diffusion is an important relaxation mechanism, only in samples with low local concentrations does deuteration of acyl chains and buffer significantly prolong Tm. In these cases, values of up to 7 μs have been achieved. Furthermore, our study revealed that membrane composition and labeling position in the membrane can also affect Tm, either by promoting the segregation of spin-labeled species or by altering their exposure to matrix protons. Effects of other experimental parameters including temperature (<50 K), presence of oxygen, and cryoprotectant type are negligible under our experimental conditions.
In the second part of the thesis, inhomogeneous distribution of spin-labels in detergent micelles has been studied. A common approach in PELDOR is measuring the distance between two covalently attached spin labels in a macromolecule or singly-labeled components of an oligomer. This situation has been described as a spin-cluster. The PELDOR signal, however, does not only contain the desired dipolar coupling between the spin-labels of the molecule or cluster under study. In samples of finite concentration the dipolar coupling between the spin-labels of the randomly distributed molecules or spin-clusters also contributes significantly. In homogeneous frozen solutions or lipid vesicle membranes this second contribution can be considered to be an exponential or stretched exponential decay, respectively. In this study, it is shown that this assumption is not valid in detergent micelles. Spin-labeled fatty acids that are randomly partitioned into different detergent micelles give rise to PELDOR time traces which clearly deviate from stretched exponential decays. As a main conclusion a PELDOR signal deviating from a stretched exponential decay does not necessarily prove the observation of specific distance information on the molecule or cluster. These results are important for the interpretation of PELDOR experiments on membrane proteins or lipophilic peptides solubilized in detergent micelles or small vesicles, which often do not show pronounced dipolar oscillations in their time traces.
In the third part, PELDOR has been utilized to study the structural flexibility of the Toc34 GTPase homodimer, a preprotein receptor of the translocon of the outer envelope of chloroplasts (TOC). Toc34 belongs to GAD subfamily of G-proteins that are regulated and activated by nucleotide-dependent dimerization. However, the function of Toc34 dimerization is not yet fully understood. Previous structural investigations of the Toc34 dimer yielded only marginal structural changes in response to different nucleotide loads. PELDOR revealed a nucleotide-dependent transition of the dimer flexibility from a tight GDP to a flexible GTP-loaded state. Substrate-binding stabilizes the dimer in the transition state mimicked by GDP-AlFx, but induces an opening in the GDP or GTP-loaded state. Thus, the structural dynamics of bona fide GTPases induced by GTP hydrolysis is replaced by substrate-dependent dimer flexibility, which represents the regulatory mode for dimerizing GTPases.
In the fourth part of the thesis, conformational flexibility and relative orientation of the N-terminal POTRA domains of a cyanobacterial Omp85 from Anabaena sp. PCC 7120, a key component of the outer membrane protein assembly machinery, were investigated by PELDOR spectroscopy. Membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. It has been suggested that the N-terminal POTRA domains (P1 and P2) might have functions in substrate recognition. Molecular dynamics (MD) simulations predicted a fixed orientation for P2 and P3 and a flexible hinge between P1 and P2. The PELDOR distances measured between the P2 and P3 POTRA domains are in good agreement with the structure determined by X-ray, and compatible with the MD simulations suggesting a fixed orientation between these domains. PELDOR constraints between the P1 and P2 POTRA domains imply a rather rigid structure with a slightly different relative orientation of these domains compared with the X-ray structure. Moreover, the large mobility predicted from MD is not observed in the frozen solution. The PELDOR results further highlight the restricted relative orientation of the POTRA domains of the Omp85-TpsB proteins as a conserved characteristic feature that might be important for the processive sliding of the unfolded substrate towards the membrane.
Künstliche Ribonucleasen, die sequenzspezifisch und effizient die Spaltung von RNA-Phosphordiesterbindungen katalysieren, könnten potenziell nicht nur als biochemische Werkzeuge dienen, sondern auch als Wirkstoffe gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, bei denen mRNA oder miRNA involviert sind, eine wichtige Rolle spielen. Obwohl in den letzten beiden Jahrzehnten zahlreiche sequenzspezifische RNA-Spalter entwickelt wurden, bleibt die Spaltaktivität dieser Verbindungen nach wie vor deutlich hinter der ihrer natürlichen Äquivalente zurück. Die Optimierung künstlicher Ribonucleasen und grundlegend dafür die Erforschung der Faktoren, die die Spaltaktivität einer Verbindung beeinflussen, sind daher weiterhin von großem Interesse. Zwar enthalten die meisten künstlichen Ribonucleasen Metallionen, doch sind auch metallfreie RNA-Spalter, zum Beispiel auf der Basis heterocyclischer Guanidine, bekannt. Prinzipiell kann die Hydrolyse des RNA-Rückgrates durch Deprotonierung der nucleophil am Phosphoratom angreifenden 2‘-OH-Gruppe, durch Protonierung der als Abgangsgruppe fungierenden 5‘-OH-Gruppe sowie durch Stabilisierung des bei der Spaltung durchlaufenen dianionischen Phosphorans katalysiert werden. Daher sollten potenzielle RNA-Spalter in der Lage sein, sowohl als Base als auch als Säure wirken zu können, was bei einem pKa-Wert im Bereich von 7 am besten gegeben ist. Fungiert ein und dasselbe Molekül als Protonenakzeptor und -donor, so kommt es im Fall von Guanidinanaloga zu einer Tautomerisierung vom Amino- zum Iminoisomer. Eine möglichst kleine Energiedifferenz zwischen beiden Formen sollte sich daher positiv auf die Spaltaktivität auswirken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe heterocyclischer Guanidine synthetisiert, deren pKa-Werte bestimmt und die jeweiligen Energiedifferenzen zwischen Amino- und Iminotautomer grob mittels AM1-Rechnungen abgeschätzt. In Spaltexperimenten wurden Cy5-markierte RNA-Substrate mit den verschiedenen Verbindungen inkubiert (Spalter-Konzentration: 2 bzw. 10 mM). Die Analyse und Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgten anschließend mithilfe eines DNA-Sequenziergerätes. Alle untersuchten und ausreichend löslichen Substanzen, die sowohl einen geeigneten pKa-Wert (6 – 8) als auch eine niedrige Energiedifferenz zwischen Amino- und Iminotautomer (≤ 5 kcal/mol) aufwiesen bzw. bei denen nur der pKa-Wert oder nur die Energiedifferenz in geringem Maße vom Idealwert abwich, spalteten RNA, wenn auch teilweise nur mit einer geringen Aktivität. In den Spaltexperimenten erwiesen sich Guanidinanaloga mit einem großen aromatischen System als besonders aktiv, allen voran 2-Aminoperimidin und seine Derivate, die auch bei Konzentrationen unter 50 µM Spaltaktivität zeigten. Gleichzeitig offenbarten diese Verbindungen in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Experimenten eine große Tendenz zur Aggregation mit RNA, so dass die Spaltung in diesen Fällen möglicherweise nicht durch Einzelmoleküle, sondern durch Aggregate erfolgte. Um RNA-Substrate auch sequenzspezifisch spalten zu können, wurden PNA-Konjugate des bereits bekannten RNA-Spalters Tris(2-aminobenzimidazol) hergestellt, wobei der Spalter über eine neue, quecksilberfreie Route synthetisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese PNA-Konjugate RNA sequenzspezifisch mit einer Halbwertszeit von etwa 11 h spalten, was im Rahmen der Halbwertszeit vergleichbarer DNA-Konjugate liegt. Um zu untersuchen, ob 2-Aminoperimidine auch als Einzelverbindungen aktiv sind, wurden zwei PNA-Konjugate von am Naphthylring substituierten 2-Aminoperimidin-Derivaten synthetisiert. Beide Konjugate zeigten keinerlei Spaltaktivität, was darauf hindeuten könnte, dass die Hydrolyse des RNA-Rückgrates nur durch mehrere Spalter-Einheiten – kovalent verknüpft oder in Form von Aggregaten – effizient katalysiert werden kann.
The NO/cGMP pathway inhibits Rap1 activation in human platelets via cGMP-dependent protein kinase I
(2005)
The NO/cGMP signalling pathway strongly inhibits agonist-induced platelet aggregation. However, the molecular mechanisms involved are not completely defined.We have studied NO/cGMP effects on the activity of Rap1, an abundant guanine-nucleotidebinding protein in platelets. Rap1-GTP levels were reduced by NO-donors and activators of NO-sensitive soluble guanylyl cyclase. Four lines of evidence suggest that NO/cGMP effects are mediated by cGMP-dependent protein kinase (cGKI): (i) Rap1 inhibition correlated with cGKI activity as measured by the phosphorylation state ofVASP, an established substrate of cGKI, (ii) 8-pCPT-cGMP, a membrane permeable cGMP-analog and activator of cGKI, completely blocked Rap1 activation, (iii) Rp- 8pCPT-cGMPS, a cGKI inhibitor, reversed NO effects and (iv) expression of cGKI in cGKI-deficient megakaryocytes inhibited Rap1 activation. NO/cGMP/cGKI effects were independent of the type of stimulus used for Rap1 activation.Thrombin-,ADPand collagen-induced formation of Rap1-GTP in platelets as well as turbulence-induced Rap1 activation in megakaryocytes were inhibited. Furthermore, cGKI inhibited ADP-induced Rap1 activation induced by the G a i -coupled P2Y12 receptor alone, i.e. independently of effects on Ca2+-signalling. From these studies we conclude that NO/cGMP inhibit Rap1 activation in human platelets and that this effect is mediated by cGKI. Since Rap1 controls the function of integrin a IIbß 3 , we propose that Rap1 inhibition might play a central role in the anti-aggregatory actions of NO/cGMP.
Die Aggregation von Thrombocyten ist ein wichtiger physiologischer Schutzmechanismus zur primären Blutstillung nach Gefäßverletzungen. Dieser Vorgang kann jedoch unter pathologischen Bedingungen zu Herzinfarkten und Schlaganfällen führen. Der Aggregationsprozeß ist durch Ausbildung sogenannter "Fibrinogenbrücken" zwischen verschiedenen Thrombocyten gekennzeichnet. Dies wird durch Bindung von Fibrinogen an das aktivierte Integrin alphaIIbbeta3 auf der Thrombocytenoberfläche ausgelöst. Das kleine G-Protein Rap1B aus der Ras-Superfamilie reguliert den Aktivitätszustand von Integrinen und besitzt damit eine zentrale Rolle bei der Aggregation von Thrombocyten. Die Aktivierung von Rap1B wird durch eine Vielzahl von Plättchenagonisten innerhalb von wenigen Sekunden ausgelöst. Der von Thrombocyten und Gefäßendothelzellen gebildete Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) kann die Thrombocytenaggregation über den NO/cGMP-Signalweg hemmen. Das Signalmolekül NO aktiviert in Thrombocyten die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (sGC), hierdurch wird die Synthese des sekundären Botenstoffes cGMP angeregt. Das cGMP-Molekül aktiviert nachfolgend die cGMP-abhängige Proteinkinase-Ibeta (cGK-Ibeta), welche die aggregationshemmende NO-Wirkung vermittelt. Die verantwortlichen Zielproteine der cGK-Ibeta wurden bis heute jedoch nicht hinreichend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Aspekte der NO-induzierten Hemmung der Thrombocytenaggregation untersucht werden. Dabei wurden neue Mechanismen dieser Inhibition identifiziert. Zum einen konnte eine kinetisch schnelle Hemmung der Rap1B-Aktivierung in Thrombocyten nachgewiesen werden. Zum anderen konnten einer cGK-Ibeta-vermittelten, kinetisch langsamen Rap1B-Phosphorylierung hemmende Effekte auf die Membranlokalisation von Rap1B in MDCK-Zellen und auf die Zellausbreitung von Hela-Zellen zugeordnet werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Proteininteraktion zwischen dem mitochondrialen CGI-51-Protein und Rap1B identifiziert und verifiziert. Zur Aufklärung eines Einflusses des NO/cGMP-Signalweges auf die Aktivierung von Rap1B in Thrombocyten wurde die NO/sGC/cGMP/cGK-Ibeta-Signalkaskade auf verschiedenen Stufen aktiviert oder gehemmt, bevor anschließend die Rap1GTPBildung mit verschiedenen Plättchenagonisten induziert wurde. Das aktive Rap1B wurde unter Verwendung eines Rap1GTP-bindenden Fusionsproteins präzipitiert und nachgewiesen. Durch NO-freisetzende Substanzen konnte eine Hemmung der Rap1BAktivierung erreicht werden. Auch die Aktivierung der sGC mit einem spezifischen Aktivator führte zur Inhibition von Rap1B. Die direkte Aktivierung der cGK-Ibeta konnte Rap1B ebenfalls hemmen, während eine Blockade der cGK-Ibeta die NO-induzierte Hemmung der Rap1-Aktivierung verhinderte. Die genannten Effekte des NO/cGMP-Signalwegs waren unabhängig vom Stimulus, der zur Rap1B-Aktivierung genutzt wurde, sowohl die Aktivierung über verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) als auch die Aktivierung über Tyrosin-Kinasen wurden gehemmt. Eine detailliertere Untersuchung ergab, daß cGK-Ibeta die Ca2+-unabhängige Aktivierung von Rap1B hemmen konnte. Die Rolle der cGK-Ibeta wurde abschließend im unabhängigen Zellsystem der Megakaryocyten abgesichert. Die Hemmung der Rap1B-Aktivierung durch den NO/cGMP-Signalweg stellt einen schnellen Regulationsmechanismus zur Inhibition der Thrombocytenaggregation dar. Aus der Literatur ist eine kinetisch langsame Phosphorylierung von Rap1B an Serin-179 durch cGK-Ibeta bekannt. Zur Ermittlung ihrer Funktion wurden mikroskopische Untersuchungen der subzellulären Rap1B-Lokalisation in lebenden MDCK-Zellen durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, daß eine nicht-phosphorylierbare Rap1BMutante eine ausgeprägte Membranlokalisation aufweist, während eine phosphomimetische Rap1B-Mutante bevorzugt cytoplasmatisch lokalisiert ist. In einer weiterführenden Studie wurde der Effekt dieser Rap1B-Mutanten auf das Zellausbreitungsverhalten von Hela-Zellen analysiert. Die Expression der nichtphosphorylierbaren Rap1B-Mutante führte dabei zu einer signifikant gesteigerten Zellausbreitung, welche hingegen durch eine phosphomimetische Rap1B-Mutante deutlich abgeschwächt war. Dies impliziert einen zusätzlichen Mechanismus, über den der NO/cGMP-Signalweg die Adhäsion bzw. die Aggregation von Thrombocyten regulieren kann. Zur Identifizierung von neuen Interaktionspartnern, die spezifisch an phosphoryliertes Rap1B binden und dessen subzelluläre Verteilung oder Aktivität regulieren, wurde das Yeast-Two-Hybrid-System eingesetzt. Hierbei konnte das mitochondriale CGI-51-Protein als neuer Bindepartner von Rap1B identifiziert und in Säugerzellen verifiziert werden. Eine phosphospezifische Interaktion konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. Das CGI-51-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Proteinsortierung in der äußeren Mitochondrienmembran. Die Funktion der Interaktion von CGI-51-Protein mit Rap1B wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß in der vorliegenden Arbeit erstmalig neue Erkenntnisse zur Regulation des kleinen G-Proteins Rap1B durch den NO/cGMP-Signalweg dargestellt sind. Dieser Regelmechanismus besitzt eine physioplogische Bedeutung bei der Inhibition der Thrombocytenaggregation.
CITIES (Chemistry and Industry for Teachers in European Schools) ist ein COMENIUS- Projekt, in dessen Rahmen Materialien für den Chemieunterricht erstellt und erprobt werden. Diese Materialien sollen Lehrkräften helfen, ihren Unterricht attraktiver zu gestalten, indem der Bezug sowohl zum Alltag und der Lebenswelt als auch zur chemischen Industrie aufgezeigt wird. Die Diskussion um eine gute Ernährung sowie empfehlenswerte und weniger empfehlenswerte Lebensmittel ist für Schülerinnen und Schüler ein weiteres interessantes Thema, das deshalb oft im Chemieunterricht im Zusammenhang mit den Themen Kohlenhydrate, Fette und Eiweiße behandelt wird. In dem für CITIES ausgewählten Beispiel wird eine ungewöhnliche Sichtweise eingenomen: Ausgangspunkt ist eine Dose mit Ravioli. Es wird nun der Frage nachgegangen, welche Funktion die Konservendose für die Konservierung der Lebensmittel hat und es werden Inhaltsstoffe der Ravioli und der Soße nachgewiesen. Insgesamt eignen sich die Thematik und die Herangehensweise für die Erarbeitung einer großen Spanne von Themenbereichen, die von der Korrosion als bis zu unterschiedlichen Nachweisen für Zucker bzw. Kohlenhydraten reichen. Aber die Chemie rund um die Raviolidose kann auch zur Wiederholung und Vertiefung von vorab erarbeiteten Inhalten etwa am Ende eines Schuljahres eingesetzt werden. Für diesen Themenbereich wurden unterschiedliche Materialien entwickelt: 1. Eine kurze Einführung gibt eine Übersicht über die gesamte Thematik. Hier werden auch historische Aspekte der Lebensmittelkonservierung angesprochen. s.a. URN: urn:nbn:de:hebis:30-85789 ; URL: http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/volltexte/2010/8578/ 2. Experimente zum Thema finden sich in einer separaten Versuchssammlung. Überwiegend handelt es sich dabei um Schülerversuche, die einfach durchgeführt werden können. Die Theorie zu den einzelnen Experimenten wird jeweils kurz aufgeführt. s.a. URN: urn:nbn:de:hebis:30-85789 ; URL: http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/volltexte/2010/8578/ 3. Die Möglichkeit der Umsetzung im Unterricht wird in einem drittel Teil exemplarisch dargestellt.
Die Ermittlung von Proteinstukturen mittels NMR-Spektroskopie ist ein komplexer Prozess, wobei die Resonanzfrequenzen und die Signalintensitäten den Atomen des Proteins zugeordnet werden. Zur Bestimmung der räumlichen Proteinstruktur sind folgende Schritte erforderlich: die Präparation der Probe und 15N/13C Isotopenanreicherung, Durchführung der NMR Experimente, Prozessierung der Spektren, Bestimmung der Signalresonanzen ('Peak-picking'), Zuordnung der chemischen Verschiebungen, Zuordnung der NOESY-Spektren und das Sammeln von konformationellen Strukturparametern, Strukturrechnung und Strukturverfeinerung. Aktuelle Methoden zur automatischen Strukturrechnung nutzen eine Reihe von Computeralgorithmen, welche Zuordnungen der NOESY-Spektren und die Strukturrechnung durch einen iterativen Prozess verbinden. Obwohl neue Arten von Strukturparametern wie dipolare Kopplungen, Orientierungsinformationen aus kreuzkorrelierten Relaxationsraten oder Strukturinformationen, die sich in Gegenwart paramagnetischer Zentren in Proteinen ergeben, wichtige Neuerungen für die Proteinstrukturrechnung darstellen, sind die Abstandsinformationen aus NOESY-Spektren weiterhin die wichtigste Basis für die NMR-Strukturbestimmung. Der hohe zeitliche Aufwand des 'peak-picking' in NOESY-Spektren ist hauptsächlich bedingt durch spektrale Überlagerung, Rauschsignale und Artefakte in NOESY-Spektren. Daher werden für das effizientere automatische 'Peak-picking' zuverlässige Filter benötigt, um die relevanten Signale auszuwählen. In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Algorithmus für die automatische Proteinstrukturrechnung beschrieben, der automatisches 'Peak-picking' von NOESY-Spektren beinhaltet, die mit Hilfe von Wavelets entrauscht wurden. Der kritische Punkt dieses Algorithmus ist die Erzeugung inkrementeller Peaklisten aus NOESY-Spektren, die mit verschiedenen auf Wavelets basierenden Entrauschungsprozeduren prozessiert wurden. Mit Hilfe entrauschter NOESY-Spektren erhält man Signallisten mit verschiedenen Konfidenzbereichen, die in unterschiedlichen Schritten der kombinierten NOE-Zuordnung/Strukturrechnung eingesetzt werden. Das erste Strukturmodell beruht auf stark entrauschten Spektren, die die konservativste Signalliste mit als weitgehend sicher anzunehmenden Signalen ergeben. In späteren Stadien werden Signallisten aus weniger stark entrauschten Spektren mit einer größeren Anzahl von Signalen verwendet. Die Auswirkung der verschiedenen Entrauschungsprozeduren auf Vollständigkeit und Richtigkeit der NOESY Peaklisten wurde im Detail untersucht. Durch die Kombination von Wavelet-Entrauschung mit einem neuen Algorithmus zur Integration der Signale in Verbindung mit zusätzlichen Filtern, die die Konsistenz der Peakliste prüfen ('Network-anchoring' der Spinsysteme und Symmetrisierung der Peakliste), wird eine schnelle Konvergenz der automatischen Strukturrechnung erreicht. Der neue Algorithmus wurde in ARIA integriert, einem weit verbreiteten Computerprogramm für die automatische NOE-Zuordnung und Strukturrechnung. Der Algorithmus wurde an der Monomereinheit der Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus Wolinella succinogenes verifiziert, deren hochaufgelöste Lösungsstruktur vorher auf konventionelle Weise bestimmt wurde. Neben der Möglichkeit zur Bestimmung von Proteinlösungsstrukturen bietet sich die NMR-Spektroskopie auch als wirkungsvolles Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Ligand- und Protein-Protein-Wechselwirkungen an. Sowohl NMR Spektren von isotopenmarkierten Proteinen, als auch die Spektren von Liganden können für das 'Screening' nach Inhibitoren benutzt werden. Im ersten Fall wird die Sensitivität der 1H- und 15N-chemischen Verschiebungen des Proteinrückgrats auf kleine geometrische oder elektrostatische Veränderungen bei der Ligandbindung als Indikator benutzt. Als 'Screening'-Verfahren, bei denen Ligandensignale beobachtet werden, stehen verschiedene Methoden zur Verfügung: Transfer-NOEs, Sättigungstransferdifferenzexperimente (STD, 'saturation transfer difference'), ePHOGSY, diffusionseditierte und NOE-basierende Methoden. Die meisten dieser Techniken können zum rationalen Design von inhibitorischen Verbindungen verwendet werden. Für die Evaluierung von Untersuchungen mit einer großen Anzahl von Inhibitoren werden effiziente Verfahren zur Mustererkennung wie etwa die PCA ('Principal Component Analysis') verwendet. Sie eignet sich zur Visualisierung von Ähnlichkeiten bzw. Unterschieden von Spektren, die mit verschiedenen Inhibitoren aufgenommen wurden. Die experimentellen Daten werden zuvor mit einer Serie von Filtern bearbeitet, die u.a. Artefakte reduzieren, die auf nur kleinen Änderungen der chemischen Verschiebungen beruhen. Der am weitesten verbreitete Filter ist das sogenannte 'bucketing', bei welchem benachbarte Punkte zu einen 'bucket' aufsummiert werden. Um typische Nachteile der 'bucketing'-Prozedur zu vermeiden, wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt der Wavelet-Entrauschung zur Vorbereitung der NMR-Daten für PCA am Beispiel vorhandener Serien von HSQC-Spektren von Proteinen mit verschiedenen Liganden untersucht. Die Kombination von Wavelet-Entrauschung und PCA ist am effizientesten, wenn PCA direkt auf die Wavelet-Koeffizienten angewandt wird. Durch die Abgrenzung ('thresholding') der Wavelet-Koeffizienten in einer Multiskalenanalyse wird eine komprimierte Darstellung der Daten erreicht, welche Rauschartefakte minimiert. Die Kompression ist anders als beim 'bucketing' keine 'blinde' Kompression, sondern an die Eigenschaften der Daten angepasst. Der neue Algorithmus kombiniert die Vorteile einer Datenrepresentation im Wavelet-Raum mit einer Datenvisualisierung durch PCA. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PCA im Wavelet- Raum ein optimiertes 'clustering' erlaubt und dabei typische Artefakte eliminiert werden. Darüberhinaus beschreibt die vorliegende Arbeit eine de novo Strukturbestimmung der periplasmatischen Polysulfid-Schwefel-Transferase (Sud) aus dem anaeroben gram-negativen Bakterium Wolinella succinogenes. Das Sud-Protein ist ein polysulfidbindendes und transferierendes Enzym, das bei niedriger Polysulfidkonzentration eine schnelle Polysulfid-Schwefel-Reduktion katalysiert. Sud ist ein 30 kDa schweres Homodimer, welches keine prosthetischen Gruppen oder schwere Metallionen enthält. Jedes Monomer enhält ein Cystein, welches kovalent bis zu zehn Polysulfid-Schwefel (Sn 2-) Ionen bindet. Es wird vermutet, dass Sud die Polysulfidkette auf ein katalytischen Molybdän-Ion transferiert, welches sich im aktiven Zentrum des membranständigen Enzyms Polysulfid-Reduktase (Psr) auf dessen dem Periplasma zugewandten Seite befindet. Dabei wird eine reduktive Spaltung der Kette katalysiert. Die Lösungsstruktur des Homodimeres Sud wurde mit Hilfe heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR-Techniken bestimmt. Die Struktur beruht auf von NOESY-Spektren abgeleiteten Distanzbeschränkungen, Rückgratwasserstoffbindungen und Torsionswinkeln, sowie auf residuellen dipolaren Kopplungen, die für die Verfeinerung der Struktur und für die relative Orientierung der Monomereinheiten wichtig waren. In den NMR Spektren der Homodimere haben alle symmetrieverwandte Kerne äquivalente magnetische Umgebungen, weshalb ihre chemischen Verschiebungen entartet sind. Die symmetrische Entartung vereinfacht das Problem der Resonanzzuordnung, da nur die Hälfte der Kerne zugeordnet werden müssen. Die NOESY-Zuordnung und die Strukturrechnung werden dadurch erschwert, dass es nicht möglich ist, zwischen den Intra-Monomer-, Inter-Monomer- und Co-Monomer- (gemischten) NOESY-Signalen zu unterscheiden. Um das Problem der Symmetrie-Entartung der NOESY-Daten zu lösen, stehen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (I) asymmetrische Markierungs-Experimente, um die intra- von den intermolekularen NOESY-Signalen zu unterscheiden, (II) spezielle Methoden der Strukturrechnung, die mit mehrdeutigen Distanzbeschränkungen arbeiten können. Die in dieser Arbeit vorgestellte Struktur wurde mit Hilfe der Symmetrie-ADR- ('Ambigous Distance Restraints') Methode in Kombination mit Daten von asymetrisch isotopenmarkierten Dimeren berechnet. Die Koordinaten des Sud-Dimers zusammen mit den NMR-basierten Strukturdaten wur- den in der RCSB-Proteindatenbank unter der PDB-Nummer 1QXN abgelegt. Das Sud-Protein zeigt nur wenig Homologie zur Primärsequenz anderer Proteine mit ähnlicher Funktion und bekannter dreidimensionaler Struktur. Bekannte Proteine sind die Schwefeltransferase oder das Rhodanese-Enzym, welche beide den Transfer von einem Schwefelatom eines passenden Donors auf den nukleophilen Akzeptor (z.B von Thiosulfat auf Cyanid) katalysieren. Die dreidimensionalen Strukturen dieser Proteine zeigen eine typische a=b Topologie und haben eine ähnliche Umgebung im aktiven Zentrum bezüglich der Konformation des Proteinrückgrades. Die Schleife im aktiven Zentrum umgibt das katalytische Cystein, welches in allen Rhodanese-Enzymen vorhanden ist, und scheint im Sud-Protein flexibel zu sein (fehlende Resonanzzuordnung der Aminosäuren 89-94). Das Polysulfidende ragt aus einer positiv geladenen Bindungstasche heraus (Reste: R46, R67, K90, R94), wo Sud wahrscheinlich in Kontakt mit der Polysulfidreduktase tritt. Das strukturelle Ergebnis wurde durch Mutageneseexperimente bestätigt. In diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass alle Aminosäurereste im aktiven Zentrum essentiell für die Schwefeltransferase-Aktivität des Sud-Proteins sind. Die Substratbindung wurde früher durch den Vergleich von [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren des Sud-Proteins in An- und Abwesenheit des Polysulfidliganden untersucht. Bei der Substratbindung scheint sich die lokale Geometrie der Polysulfidbindungsstelle und der Dimerschnittstelle zu verändern. Die konformationellen Änderungen und die langsame Dynamik, hervorgerufen durch die Ligandbindung können die weitere Polysulfid-Schwefel-Aktivität auslösen. Ein zweites Polysulfid-Schwefeltransferaseprotein (Str, 40 kDa) mit einer fünffach höheren nativen Konzentration im Vergleich zu Sud wurde im Bakterienperiplasma von Wolinella succinogenes entdeckt. Es wird angenommen, dass beide Protein einen Polysulfid-Schwefel-Komplex bilden, wobei Str wässriges Polysulfid sammelt und an Sud abgibt, welches den Schwefeltransfer zum katalytischen Molybdän-Ion auf das aktive Zentrum der dem Periplasma zugewandten Seite der Polysulfidreduktase durchführt. Änderungen chemischer Verschiebungen in [15N,1H]-TROSY-HSQC-Spektren zeigen, dass ein Polysulfid-Schwefeltransfer zwischen Str und Sud stattfindet. Eine mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungsfläche konnte bestimmt werden. In der Abwesenheit des Polysulfidsubstrates wurden keine Wechselwirkungen zwischen Sud und Str beobachtet, was die Vermutung bestätigt, dass beide Proteine nur dann miteinander wechselwirken und den Polysulfid-Schwefeltransfer ermöglichen, wenn als treibende Kraft Polysulfid präsent ist.
The reactive intermediate methyleneaminoacetonitrile H2C = N - C H2 - CN has been generated via thermal retrotrimerization of N ,N',N"-tris(cyanomethyl)hexahydro-s-triazine and characterized by its photoelectron, mass and low-temperature NMR spectra. A fully geometryoptimized MNDO calculation allows to assign the observed ionization energies and yields estimates for other molecular properties, e.g. a rather high dipole moment.
In the mol-ecule of the title compound, C(12)H(12)BrN(3)O, the fused-ring system is essentially planar, the largest deviation from the mean plane being 0.0148 (3) Å. The two allyl groups are nearly perpendicular to the imidazo[4,5-b]pyridine plane [C-C-N-C torsion angles of 81.6 (4) and -77.2 (4)°] and point in the same direction. The planes through the atoms forming each allyl group are nearly perpendicular to the imidazo[4,5-b]pyridin-2-one system, as indicated by the dihedral angles between them of 80.8 (5) and 73.6 (5)°.
In the title compound, C15H14N2O4, (I), the molecule lies on a twofold rotation axis which passes through the central C atom of the aliphatic chain, giving one half-molecule per asymmetric unit. The structure is a monoclinic polymorph of the triclinic structure previously reported [Brito, Vallejos, Bolte & López-Rodríguez (2010). Acta Cryst. E66, o792], (II). The most obvious difference between them is the O/C/C/C—O/C/C/C torsion angle [58.2 (7)° in (I) and 173.4 (3)/70.2 (3)° in (II) for GG and TG conformations, respectively]. Another important difference is observed in the dihedral angle between the planes of the aromatic rings [86.49 (7)° for (I) and 76.4 (3)° for (II)]. The crystal structure features a weak π–π interaction [centroid–centroid distance = 4.1397 (10)Å]; this latter kind of interaction is not evident in the triclinic polymorph.
Electron cryo-microscopy analyzes the structure of proteins and protein complexes in vitrified solution. Proteins tend to adsorb to the air-water interface in unsupported films of aqueous solution, which can result in partial or complete denaturation. We investigated the structure of yeast fatty acid synthase at the air-water interface by electron cryo-tomography and single-particle image processing. Around 90% of complexes adsorbed to the air-water interface are partly denatured. We show that the unfolded regions face the air-water interface. Denaturation by contact with air may happen at any stage of specimen preparation. Denaturation at the air-water interface is completely avoided when the complex is plunge-frozen on a substrate of hydrophilized graphene.
Bacteria have adapted their NhaA Na(+)/H(+) exchangers responsible for salt homeostasis to their different habitats. We present an electrophysiological and kinetic analysis of NhaA from Helicobacter pylori and compare it to the previously investigated exchangers from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Properties of all three transporters are described by a simple model using a single binding site for H(+) and Na(+). We show that H.pylori NhaA only has a small acidic shift of its pH-dependent activity profile compared to the other transporters and discuss why a more drastic change in its pH activity profile is not physiologically required.
Na(+)/H(+) exchangers are essential for regulation of intracellular proton and sodium concentrations in all living organisms. We examined and experimentally verified a kinetic model for Na(+)/H(+) exchangers, where a single binding site is alternatively occupied by Na(+) or one or two H(+) ions. The proposed transport mechanism inherently down-regulates Na(+)/H(+) exchangers at extreme pH, preventing excessive cytoplasmic acidification or alkalinization. As an experimental test system we present the first electrophysiological investigation of an electroneutral Na(+)/H(+) exchanger, NhaP1 from Methanocaldococcus jannaschii (MjNhaP1), a close homologue of the medically important eukaryotic NHE Na(+)/H(+) exchangers. The kinetic model describes the experimentally observed substrate dependences of MjNhaP1, and the transport mechanism explains alkaline down-regulation of MjNhaP1. Because this model also accounts for acidic down-regulation of the electrogenic NhaA Na(+)/H(+) exchanger from Escherichia coli (EcNhaA, shown in a previous publication) we conclude that it applies generally to all Na(+)/H(+) exchangers, electrogenic as well as electroneutral, and elegantly explains their pH regulation. Furthermore, the electrophysiological analysis allows insight into the electrostatic structure of the translocation complex in electroneutral and electrogenic Na(+)/H(+) exchangers.
Im Rahmen einer genomumfassenden Suche nach biologisch aktiven Proviren des Typs HERV-K konnten insgesamt zwei Genorte den humanen Chromosomen C7 bzw. C19 zugeordnet werden. Beide Proviren weisen ORF für die retroviralen Gene gag, pol und env auf. Während der Genort HERV-K(C19) infolge eine Punktmutation ein defektes Proteasegen trägt und durch eine Deletion der 5´LTR transkriptionell inaktiv ist, besitzt der Genort HERV- K(C7) zwei intakte LTRs, deren Homologiegrad auf ein phylogenetisch junges Alter hindeutet. Mit Ausnahme eines Aminosäureaustausches innerhalb eines hochkonservierten Sequenzmotivs der reversen Transkriptase, der den Verlust der enzymatischen Aktivität zur Folge hat, kann der Genort HERV-K(C7) als das derzeit intakteste Provirus der Familie HERV-K angesehen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine HTDV- Partikelproduktion durch Komplementation unterschiedlicher Genorte und gegen die Existenz eines funktionellen und vermehrungsfähigen HERV-K Provirus mit allen retroviralen Charakteristika im menschlichen Genom. Desweiteren wurden mit HERV-K10 und HERV-K18 zwei bekannte Vertreter der Familie HERV-K eingehend untersucht. Zusätzlich zu der chromosomalen Zuordnung der Proviren gelang der experimentelle Nachweis eines intakten gag Genes für HERV-K10. Für HERV- K18 konnten ausgeprägte Homologien zu dem Superantigen-kodierenden Provirus IDDMK1,222 festgestellt werden. Bei den in dieser Arbeit vorgestellten Klonen pPERV-B(33), pPERV-A(42) und pPERV- B(43) handelt es sich um die ersten intakten Proviren der xenotropen Klassen PERV-A und PERV-B. Die vollständige Sequenzierung ermöglichte eine eingehende molekularbiologische Charakterisierung dieser C-Typ Viren. Computergestützt konnte eine PBS für eine tRNAGly4 sowie das Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Der Sequenzvergleich offenbarte ein repetitives 39 bp Motiv, welches in unterschiedlicher Anzahl in den jeweiligen LTRs vorzufinden ist. Experimentell wurden der Transkriptionsstart und die verwendeten Spleißstellen identifiziert. Durch Rekombination konnten die molekularen Klone pPERV- B(33)/ATG und pPERV-B(43)/LTR generiert werden, die nach Transfektion in 293 Zellen zur Produktion infektiöser Partikel führten, welche sich seriell passagieren liessen. Mit Kenntnis der Genomorganisation und der RNA Expressionscharakteristika von PERV wurde eine RT PCR Virusdiagnostik etabliert mit deren Hilfe hochsensitiv differentiell PERV-A und PERV-B Transkripte detektiert werden können.
Small molecule inhibitors sensitize neuroblastoma cells for chemotherapeutic drug-induced apoptosis
(2015)
Neuroblastoma (NB) is one of the most common solid extracranial pediatric tumors, deriving from undifferentiated cells of the peripheral nervous system. It accounts for approximately 10% of all childhood cancers. High stage tumors usually show poor prognosis despite aggressive treatment such as radiotherapy or chemotherapy. Therefore, it is of utmost importance to find novel treatment strategies in order to improve existing chemotherapy protocols. Combination treatment offers advantages, as chemotherapeutic drugs can be applied in low and subtoxic doses, reducing possible side-effects. Here, we report in a two-part study that small molecule inhibitors (SMI), namely BI 2536, a PLK1 inhibitor and BV6, a SMAC mimetic (SM), sensitize neuroblastoma cells for chemotherapeutic drug-induced cell death. By using i) BI 2536 in combination with vinca alkaloids and ii) BV6 in combination with either doxorubicin or vinca alkaloids, we show that cell death is synergistically enhanced compared to monotherapy. Furthermore, combination treatment significantly reduces survival of NB cells in long-term assays, compared to single treatment. We identify that vinca alkaloid/SMI combinations induce mitotic arrest, as shown by phosphorylation of histone H3, which results in the induction of intrinsic apoptosis and inhibition of CDK1 by RO-3306 could abolish these findings. Mechanistically, upon vinca alkaloid/SMI-induced mitotic arrest, anti-apoptotic BCL-2 proteins such as MCL-1, BCL-2 or BCL-XL are degraded or inactivated by phosphorylation, which induces the activation of the proapoptotic BCL-2 family proteins BAX and BAK. The importance of the mitochondrial apoptosis pathway in vinca alkaloid/SMI-induced cell death was further highlighted by the fact that ectopic expression of BCL-2 inhibits vinca alkaloid/SMI-induced DNA fragmentation and BAK- and caspase-activation. In contrast to the vinca alkaloid/SMI cotreatment, DOX/SMI (DOX/BV6)-induced apoptosis only partially involves the mitochondrial pathway. Instead, we clarify that RIP1 is required for DOX/BV6-induced apoptosis, as pharmacological and genetic inhibition of RIP1 rescues from apoptosis induction. Although it has been shown in previous studies that SM-treatment (e.g. BV6) can induce the NF-κB pathway and auto-/paracrine TNFα production through cIAP1/2 depletion, DOX/BV6-induced apoptosis is completely independent of NF-κB activation in our setting, despite fast cIAP1 depletion. This conclusion is based on the fact that inhibition of the NF-κB pathway by exogenously expressed dominant-negative IκBα as well as application of a TNFα blocking antibody does not reduce DOX/BV6-induced cell death. In summary, we unravel two new promising treatment strategies for neuroblastoma patients by using a combination treatment of two different small molecule inhibitors, combined with well-characterized chemotherapeutic agents. Furthermore we give detailed insights into cell death pathways induced by these combination treatments, in which mitochondria and RIP1 have a differential role in chemotherapeutic drug-induced apoptosis.
The title compound, C15H25N5, is an aminalization product between 2,6-diacetylpyridine and 1,3-diaminopropane. It crystallizes with two independent molecules in the asymmetric unit with different conformations. In the first molecule, the methyl groups are cis oriented with respect to the pyridine ring [N—C—C—C torsion angles = 72.5 (1) and 80.3 (1)°], while they are trans oriented in the second molecule [N—C—C—C torsion angles = 82.6 (1) and -90.8 (1)°]. Each of the two molecules forms centrosymmetric dimers held together by N—H[cdots, three dots, centered]N hydrogen bonds, thus forming R 2 2(16) rings. The two dimers are interlinked by additional N—H[cdots, three dots, centered]N bonds into R 4 4(14) rings, building chains along the a axis. These patterns influence the orientation (either equatorial or axial) of the N—H bonds.
Crystals of the title compound, C12H8N2·C7H8O2, were obtained during cocrystallization experiments of a compound with two hydrogen-bond donors (2-hydroxybenzyl alcohol) with another compound containing two hydrogen-bond acceptors (phenanthroline). Unexpectedly, the two molecules do not form dimers with two O—H ... N hydrogen bonds connecting the two molecules. However, one of the hydroxy groups forms a bifurcated hydrogen bond to both phenanthroline N atoms, whereas the other hydroxy group forms an O—H ... O hydrogen bond to a symmetry-equivalent 2-hydroxybenzyl alcohol molecule. In addition, the crystal packing is stabilized by Pi – Pi interactions between the two phenanthroline ring systems, with a centroid–centroid distance of 3.570 Å.
In the crystal of the title compound [systematic name: 2-(3,5-diamino-6-chloropyrazin-2-ylcarbonyl)guanidinium chloride methanol disolvate], C6H9ClN7O+·Cl-·2CH3OH , the components are connected by N—H ... N, N—H ... Cl, N—H ... O, O—H ... Cl and O—H ... O hydrogen bonds into a three-dimensional network. The dihedral angle between the aromatic ring and the guanidine residue is 6.0 (2)°.
The title compound, C6H5NO2·C6H6O2, crystallizes with one pyridinium-2-carboxylate zwitterion and one molecule of benzene-1,2-diol in the asymmetric unit. The crystal structure is characterized by alternating molecules forming zigzag chains running along the a axis: the molecules are connected by O—H ... O and N—H ... (O,O) hydrogen bonds.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
The centerpiece of all neuronal processes is the synaptic transmission. It consists of a complex series of events. Two key elements are the binding of synaptic vesicles (SV) to the presynaptic membrane and the subsequent fusion of the two membranes. SV are neurotransmitter-filled membranous spheres with many integral and peripheral proteins. The synaptic SNARE complex consists of three interacting proteins, which energize and regulate the fusion of the SV membrane with the presynaptic membrane. Both processes are closely orchestrated to ensure a specific release of neurotransmitter. Already many experiments have been performed, such as genetic screens and proteome analysis of SV, to determine the functions of the various proteins involved. Nevertheless, the functions of the identified proteins are still not fully elucidated. The aim of this thesis was initially applying a tandem affinity purification (TAP) of SV to identify unknown interaction partner of SV and to determine their role. This was supposed to be performed in the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans). The underlying mechanisms are conserved throughout the phylogentic tree and identified interaction partners will help to understand the processes in the mammalian brain. Although there is no neuron-rich tissue in C. elegans as in other model organisms, the diverse genetic methods allows a rapid creation of modified organisms and a prompt determination of the function of identified proteins. The integral SV protein synaptogyrin has been fused to a TAP-tag. The TAP-tag consists of a ProteinA, a TEV protease cleavage site and a calmodulin binding peptide (CBP). Both affinity purification steps are performed sequentially and allow a highly specific native purification of proteins and their interaction partners. Due to technical difficulties the purification strategy was modified several times during the course of this thesis and then finally abandoned for a more promising project, the SNARE complex purification. In conclusion, one of the reasons was the necessary lack of detergent.
The amended aim of this thesis has been the TAP of solubilized SNARE complex to identify unknown interaction partner and to determine their role. In order to increase the specificity of the purification, in terms of formed complexes, the two SNARE subunits, synaptobrevin (SNB-1 in C. elegans) and syntaxin (UNC-64 in C. elegans), were separately fused to the different affinity tags. As the modifications of the proteins could impair their function and lead to false interaction partners, their functionality was tested. For this purpose, the corresponding fusion constructs were expressed in strains with mutated snb¬1 and unc-64. Non-functional synaptic proteins display an altered course of paralysis in an aldicarb assay. The fusion proteins which were expressed in their respective mutant strains displayed a near to wild-type (WT) behavior in contrast to the naive mutant strains. Multiple TAP demonstrated SNB-1 signals in Western blot analysis and complex sets of proteins in the final elution step in a silver staining of SDS-PAGEs. These samples were sent with negative control (WT purification) for MS analysis to various cooperation partners. 119 proteins were identified which appeared only in data sets with SNARE proteins and not in WT samples. If proteins were detected in ≥ 2 SNARE positive MS analysis and had known neural functions or homologies to neuronal proteins in other species, they were selected for further analysis. These candidates were knocked down by RNAi and tested for synaptic function in a following aldicarb assay. The treatment with their specific RNAi resulted for mca-3 in a strong resistance, while frm-2, snap-29, ekl-6, klb-8, mdh-2, pfk-2, piki-1 and vamp-8 resulted in hypersensitivity. The most responsive genes frm-2, snap-29 and mca-3 were examined, whether they displayed a co-localization together with synaptobrevin in promoter fusion constructs or functional fusion constructs. In fluorescence microscopy images only MCA-3::YFP demonstrated neuronal expression.
In order to substantiate the synaptic nature and functionality of the MCA-3::YFP a swimming assay was performed. Here, fusion construct expressing strains, which contained mutated mca-3, were compared with untreated mutant strains and WT strains according to their behavior. In this swimming assay a partial restoration of WT behavior was shown in the MCA-3::YFP expressing mutant strains. Based on these data, we discovered with MCA 3 a new interaction partner of the SNARE complex. MCA-3 is a plasma membrane Ca2+-ATPase and was initially seen only in their role in the endocytosis. Its new putative role is the reduction of Ca2+ concentration at the bound SNARE complex. Since an interaction of syntaxin with Ca2+ channels has been demonstrated, it would be comprehensible to reduce the local concentration of Ca2+ to a minimum by tethering Ca2+ transporters to the SNARE complex.
The cytochrome bc1 complex recycles one of the two electrons from quinol (QH2) oxidation at center P by reducing quinone (Q) at center N to semiquinone (SQ), which is bound tightly. We have analyzed the properties of SQ bound at center N of the yeast bc1 complex. The EPR-detectable signal, which reports SQ bound in the vicinity of reduced bH heme, was abolished by the center N inhibitors antimycin, funiculosin, and ilicicolin H, but was unchanged by the center P inhibitors myxothiazol and stigmatellin. After correcting for the EPR-silent SQ bound close to oxidized bH, we calculated a midpoint redox potential (Em) of approximately 90 mV for all bound SQ. Considering the Em values for bH and free Q, this result indicates that center N preferentially stabilizes SQ.bH(3+) complexes. This favors recycling of the electron coming from center P and also implies a >2.5-fold higher affinity for QH2 than for Q at center N, which would potentially inhibit bH oxidation by Q. Using pre-steady-state kinetics, we show that Q does not inhibit the initial rate of bH reduction by QH2 through center N, but does decrease the extent of reduction, indicating that Q binds only when bH is reduced, whereas QH2 binds when bH is oxidized. Kinetic modeling of these results suggests that formation of SQ at one center N in the dimer allows stabilization of SQ in the other monomer by Q reduction after intradimer electron transfer. This model allows maximum SQ.bH(3+) formation without inhibition of Q binding by QH2.
We have investigated the mechanism responsible for half-of-the-sites activity in the dimeric cytochrome bc(1) complex from Paracoccus denitrificans by characterizing the kinetics of inhibitor binding to the ubiquinol oxidation site at center P. Both myxothiazol and stigmatellin induced a 2-3 nm shift of the visible absorbance spectrum of the b(L) heme. The shift generated by myxothiazol was symmetric, with monophasic kinetics that indicate equal binding of this inhibitor to both center P sites. In contrast, stigmatellin generated an asymmetric shift in the b(L) spectrum, with biphasic kinetics in which each phase contributed approximately half of the total magnitude of the spectral change. The faster binding phase corresponded to a more symmetrical shift of the b(L) spectrum relative to the slower binding phase, indicating that approximately half of the center P sites bound stigmatellin more slowly and in a different position relative to the b(L) heme, generating a different effect on its electronic environment. Significantly, the slow stigmatellin binding phase was lost as the inhibitor concentration was increased. This implies that a conformational change is transmitted from one center P site in the dimer to the other upon stigmatellin binding to one monomer, rendering the second site less accessible to the inhibitor. Because the position that stigmatellin occupies at center P is considered to be analogous to that of the quinol substrate at the moment of electron transfer, these results indicate that the productive enzyme-substrate configuration is prevented from occurring in both monomers simultaneously.
NMR and chromatography methods combined with mass spectrometry are the most important analytical techniques employed for plant metabolomics screening. Metabolomic analysis integrated to transcriptome screening add an important extra dimension to the information flow from DNA to RNA to protein. The most useful NMR experiment in metabolomics analysis is the proton spectra due the high receptivity of 1H and important structural information, through proton–proton scalar coupling. Routinely, databases have been used in identification of primary metabolites, however, there is currently no comparable data for identification of secondary metabolites, mainly, due to signal overlap in normal 1H NMR spectra and natural variation of plant. Related to spectra overlap, alternatively, better resolution can be find using 1H pure shift and 2D NMR pulse sequence in complex samples due to spreading the resonances in a second dimension. Thus, in data brief we provide a catalogue of metabolites and expression levels of genes identified in soy leaves and roots under flooding stress.
Mammalian oocytes are arrested in the dictyate stage of meiotic prophase I for long periods of time, during which the high concentration of the p53 family member TAp63α sensitizes them to DNA damage-induced apoptosis. TAp63α is kept in an inactive and exclusively dimeric state but undergoes rapid phosphorylation-induced tetramerization and concomitant activation upon detection of DNA damage. Here we show that the TAp63α dimer is a kinetically trapped state. Activation follows a spring-loaded mechanism not requiring further translation of other cellular factors in oocytes and is associated with unfolding of the inhibitory structure that blocks the tetramerization interface. Using a combination of biophysical methods as well as cell and ovary culture experiments we explain how TAp63α is kept inactive in the absence of DNA damage but causes rapid oocyte elimination in response to a few DNA double strand breaks thereby acting as the key quality control factor in maternal reproduction.
The research presented in this thesis characterizes U2AF homology motifs (UHM) and their interactions with UHM ligand motifs (ULM) in the context of splicing regulation. UHM domains are a subgroup of RNA recognition motifs (RRM) originally discovered in the proteins U2AF65 and U2AF35. Whereas canonical RRMs are usually involved in binding of RNA, UHM domains bind tryptophan containing linear protein motifs (ULM) instead. In the first article, we analyze the complex network of interactions between splicing factors and RNA that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´ splice site of an intron. The protein U2AF65 binds a pyrimidine-rich element in introns and recruits U2snRNP by binding its protein component SF3b155. My contribution was to define the binding site of the protein U2AF65 to the intrinsically unstructured N-terminus of the scaffolding protein SF3b155. I could show that the UHM domain of U2AF65 recognizes a ULM in SF3b155, and that this binding site is not overlapping with the binding sites of other splicing factors, like p14, to SF3b155. As the U2AF65-UHM:SF3b155-ULM interaction is mutually exclusive with an interaction between U2AF65-UHM and a ULM in the splicing factor SF1, which was reported to initially recognize the branch point sequence, my results provide the molecular details on how SF3b155 replaces SF1 during spliceosomal reorganizations. In the second article, we show that overexpression of the UHM domain of the splicing factor SPF45 induces exon 6 skipping in the pre-mRNA of Fas (CD95/APO-1). I provide evidence for in vitro binding of SPF45-UHM to ULM sequences in the splicing factors U2AF65, SF1, and SF3b155. I crystallized free and SF3b155-bound SPF45 UHM and solved both structures by X-ray crystallography. The analysis of the complex interface and sequence differences in the ULMs allowed me to design mutations of SPF45-UHM, which selectively inhibit binding to distinct ULMs. After assessing the ULM binding properties in vitro, we could show that the activity of SPF45-UHM in influencing the splicing pattern of Fas relies on interactions with SF3b155 and/or SF1, but that an interaction with U2AF65 is dispensable. A mechanism for the activity of SPF45-UHM could thus be engaging in ULM interactions and thus interfering with the network of interactions that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´splice site, as described above. In the third article, we describe an unusual flexible homodimerization mode of the UHM in the splicing factor Puf60, which enables simultaneous interactions with ULM sequences on other splicing factors. I could show that the NMR relaxation properties of Puf60-UHM are inconsistent with a model of a rigid dimer, but rather indicate a dimerization via a flexible linker. I identified a flexible loop in the peptide backbone of Puf60-UHM, and showed that mutiation of acidic residues in this loop impairs the dimerization. To analyze the dimerization interface in further detail, I solved the structure of Puf60-UHM by X-ray crystallography. The acidic residues in the flexible loop of one UHM dimer subunit mediate the dimerization by contacting basic residues on the β-sheet surface of the other dimer subunit. Differences in the four dimer interfaces observed for the eight molecules in the asymmetric unit of the crystal support the model of an undescribed, flexible mode of dimerization, and thus complement the NMR relaxation data. Furthermore, I could show that the Puf60-UHM dimer and U2AF65-UHM contact different ULM sequences on the SF3b155 N-terminus in vitro, thus providing a possible explanation for the mutual cooperative activation of Puf60 and U2AF65 in splicing assays described in the literature. The fourth article is a review about recent research on the recognition of DNA double strand breaks (DSB) by covalent histone modifications. The p53 binding protein 1 (53BP1) is a DSB sensor and a checkpoint protein for mitosis. Recent crystallographic evidence indicates that 53BP1 recognizes DSB sites by binding histone H4 dimetylated at lysine 20 (H4-K20). We provide a comprehensive overview of the atomic resolution structures that revealed how proteins can specifically recognize histone tail modifications, especially methylated lysines, to read the information stored in what is called the histone code.
Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are currently the standard chemotherapeutic agents for the treatment of chronic myeloid leukemia (CML). However, due to TKI resistance acquisition in CML patients, identification of new vulnerabilities is urgently required for a sustained response to therapy. In this study, we have investigated metabolic reprogramming induced by TKIs independent of BCR-ABL1 alterations. Proteomics and metabolomics profiling of imatinib-resistant CML cells (ImaR) was performed. KU812 ImaR cells enhanced pentose phosphate pathway, glycogen synthesis, serine-glycine-one-carbon metabolism, proline synthesis and mitochondrial respiration compared with their respective syngeneic parental counterparts. Moreover, the fact that only 36% of the main carbon sources were utilized for mitochondrial respiration pointed to glycerol-phosphate shuttle as mainly contributors to mitochondrial respiration. In conclusion, CML cells that acquire TKIs resistance present a severe metabolic reprogramming associated with an increase in metabolic plasticity needed to overcome TKI-induced cell death. Moreover, this study unveils that KU812 Parental and ImaR cells viability can be targeted with metabolic inhibitors paving the way to propose novel and promising therapeutic opportunities to overcome TKI resistance in CML.
Excitation of CO molecules into the lowest vibrational level of the B1Σ+ electronic state by absorption of the (B 1Σ+υ′=0 →X 1Σ+ ,υ′′=0) resonance band at 1150 Å has been studied under various experimental conditions by observing the steady state fluorescence of the (B 1Σ+→A1Π) Angstrom bands. Stern-Volmer plots of the fluorescence intensities at the addition of various foreign gases yielded straight lines whose slopes k̃qм = kqм · τeff were strongly dependent on the CO sample pressure. This effect was found to be due to changes of the effective radiative lifetime of the B 1Σ+υ′=0 because of resonance trapping of the (0,0) band of the (B → X) fluorescence. The CO(B 1Σ+υ′=0) molecules are found to be quenched by He, Ne, Ar, H2 and D2 with effective collision cross sections of 0.23, 0.48, 22.4, 10.7, and 11.4 Å2, respectively, at 298 °K. In addition, an approximate value for the ratio ABA/ (ABA+ABX)of the radiative transition probabilities of the (B → A) and (B → X) transitions could be derived from the measurements.
Das OH-Radikal, bestehend aus einem Sauerstoff- und einem Wasserstoffatom, ist verantwortlich für den Selbstreinigungsmechanismus der Atmosphäre. Als Oxidationsmittel reagiert es mit praktisch allen Spurengasen, wie z. B. dem giftigen Kohlenmonoxid, dem Treibhausgas Methan und dem Schwefeldioxid, und macht sie wasserlöslich, so daß sie im Regen gelöst ausgewaschen werden können (Waschmitteleffekt). Welche Schlüsselstellung das OH-Radikal in der Atmosphärenchemie hat, beschreibt der Chemiker Franz Josef Comes. Gleichzeitig stellt er das weltweit empfindlichste Absolutverfahren zur Bestimmung von troposphärischen OH-Konzentrationen vor, das in Frankfurt entwikkelt und zur Zeit getestet wird.
Photofragmentation spectroscopy—the study of "half collisions" with polarized light of subdoppler line width—opens a window to look into the structure of molecules. The energy partitioning among the particular degrees of freedom of the products of the fragmentation reaction is described by the scalar properties, the direction and magnitude of a particular type of motion is described by the vector properties. The measurement of the scalar and vector properties allows a pictorial view of the intermediate state. The forces which make the fragments fly apart or rotate and vibrate can be "seen" from the line shapes. Information on the unstable intermediate state is gained from the stable fragments long after the dissociation of the parent molecule. In particular, information on the "lifetime" of the intermediate on a femtosecond time scale can be obtained.
A number of molecules, mainly three and four atomic, have been studied by this technique. Hydrogen peroxide has shown up as a textbook example. A complete analysis was possible including not only correlation of different types of fragment motion but also a correlation of the two coincident particles formed from the same parent molecule. The experimental results are in full agreement with recent calculations of the dynamics of the fragmentation on newly obtained potential energy surfaces. Hydrogen peroxide shows a strong dependence of its potential energy on the dihedral angle in the two electronic states amenable to laser excitation. This experiment further demonstrates that an analysis is also possible if two states are excited simultaneously.
Another good example is the fragmentation of hydrazoic acid for which also coincident pair correlation has been treated. Here again the results agree excellently with a qualitative picture which can be drawn from recently calculated ab initio potential energy surfaces. The HN3 example is much more complicated than the former one due to its higher structured upper potential energy surface. Strong rotational excitation is observed in the N2 fragment leaving the NH fragment rotationally cold.
The treatment of vector correlations in molecular photofragmentation is a powerful tool for the study of the dynamics of molecular dissociation reactions.
The MAM (meprin/A5-protein/PTPmu) domain is present in numerous proteins with diverse functions. PTPμ belongs to the MAM-containing subclass of protein-tyrosine phosphatases (PTP) able to promote cell-to-cell adhesion. Here we provide experimental evidence that the MAM domain is a homophilic binding site of PTPμ. We demonstrate that the MAM domain forms oligomers in solution and binds to the PTPμ ectodomain at the cell surface. The presence of two disulfide bridges in the MAM molecule was evidenced and their integrity was found to be essential for MAM homophilic interaction. Our data also indicate that PTPμ ectodomain forms oligomers and mediates the cellular adhesion, even in the absence of MAM domain homophilic binding. Reciprocally, MAM is able to interact homophilically in the absence of ectodomain trans binding. The MAM domain therefore contains independent cis and trans interaction sites and we predict that its main role is to promote lateral dimerization of PTPμ at the cell surface. This finding contributes to the understanding of the signal transduction mechanism in MAM-containing PTPs.