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Simon Joshua Rainer Schneider

• Inorganic phosphate is one of the most abundant and essential nutrients in living organisms. It plays an indispensable role in energy metabolism and serves as a building block for major cellular components such as the backbones of DNA and RNA, headgroups of phospholipids and in posttranslational modifcations of many proteins. Disturbances in cellular phosphate homeostasis have a detrimental effect on the viability of cells. There- fore, both the import and export of phosphate is strictly regulated in eukaryotic cells. In the eukaryotic model organism Saccharomyces cerevisiae, the uptake of phosphate is carried out either by transporters with high affinity or by transporters with low affinity, depending on the cytosolic phosphate concentration. While structures are available for homologues of the high-affinity transporters, no structures of low-affinity transporters have been solved so far. Interestingly, only the low-affinity transporters have a regulatory SPX domain, which is found in various proteins involved in phosphate homeostasis. In this work, structures of Pho90 from Saccharomyces cerevisiae, a low-affinity phosphate transporter, were solved by cryo-EM, providing insights into its transport mechanism. The dimeric structure resembles the structures of proteins of the divalent anion symporter superfamily (DASS) and of mammalian transporters of the solute carrier 13 (SLC13) family. The transmembrane domain of each protomer consists of 13 helical elements and can be subdivided into scaffold and transport domains. The structure of ScPho90 in the presence of phosphate shows the phosphate binding site within the transporter domain in an outward-open conformation with a bound phosphate ion and two sodium ions. In the absence of phosphate, an asymmetric dimer structure was determined, with one protomer adopting an inward-open conformation. While the dimer contact and the scaffold domain are identical in both conformations, the transport domain is rotated by about 30° and shifted by 11 Å towards the cytoplasmic side, leading to the accessibility of the binding pocket from the cytoplasm. Based on these findings and by comparison with known structures, a phosphate transport mechanism is proposed in the present work that involves substrate binding on the extracellular side, conformational change by a rigid-body motion of the transport domain, in an "elevator-like" motion, and substrate release into the cytoplasm. The regulatory SPX domain is not well resolved in the ScPho90 structures, so that no direct conclusions were drawn about its regulatory mechanism. The findings provide new insights into the function and mechanism of eukaryotic low-affinity phosphate transporters. While eukaryotic cells express various phosphate import proteins, most eukaryotes have only a single highly conserved and essential phosphate exporter. These exporters show no sequence homology to other transporters of known structure, but also possess a regulatory SPX domain. In this work, the structural basis for eukaryotic phosphate export is investigated by elucidating the structures of the homologous phosphate exporters Syg1 from Saccharomyces cerevisiae and Xpr1 from Homo sapiens, using cryo-EM. The structures of ScSyg1 and HsXpr1 show a conserved homodimeric structure and the transmembrane part of each protomer consists of 10 TM helices. Helix TM1 establishes the dimer contact by means of a glycine zipper motif, which is a known oligomerization motif. Helices TM2-5 form a hydrophobic pocket that has density for a lipid molecule. Whether the lipid binding into the hydrophobic pocket has an allosteric effect on the phosphate export activity or only serves protein stabilization is not known. Helices TM5-10 form a six-helix bundle, which constitutes a putative phosphate translocation pathway in its center. This bundle is formed by the protein sequence annotated as EXS domain. The respective phosphate translocation pathways of ScSyg1 and HsXpr1 show structural differences. While the translocation pathway in HsXpr1 is accessible from the cytoplasm, in ScSyg1 it is closed by a large loop of the SPX domain. Interestingly, this loop is not conserved in higher eukaryotes and is therefore not present in HsXpr1. Another difference are distinct conformations of helix TM9. In ScSyg1, TM9 adopts a kinked conformation, which results in the translocation pathway being open to the extracellular side. In contrast, TM9 adopts a straight conformation in HsXpr1, resulting in the placement of a highly conserved tryptophane residue in the middle of the translocation pathway. As a result, the translocation pathway in HsXpr1 is closed to the extracellular side.
• Anorganisches Phosphat ist einer der am häufigsten vorkommenden und wichtigsten Nährstoffe in lebenden Organismen. Es spielt eine unverzichtbare Rolle im Energiestoffwechsel und ist ein elementarer Baustein vieler Zellbestandteile. Es findet sich zum Beispiel im Rückgrat von DNA- und RNA-Molekülen, in Kopfgruppen von Phospholipiden und dient als posttranslationale Modifikation vieler Proteine. Die zelluläre Phosphatkonzentration muss streng reguliert werden, da ein Phosphatmangel zu Wachstumsproblemen führt, was wiederum zelluläre Autophagie auslöst. Andererseits führen überhöhte Phosphatkonzentrationen zu Störungen im Energiestoffwechsel von Zellen und somit zu einer verminderten Lebensfähigkeit, was mit der Entstehung verschiedener Krankheiten in Verbindung gebracht wird. Die Phosphathomöostase auf zellulärer Ebene ist am besten in dem eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae charakterisiert. Ein gemeinsames Merkmal der an der Phosphatregulierung in Hefe beteiligten Proteine, ist das Vorhandensein einer SPX-Domäne. Vorausgegangene Studien lösten die 3D-Struktur dieser Domäne und zeigten, dass sie Inositolhexakisphosphat (InsP 6 ) sowie dessen Pyrophosphatderivate (InsPPs) bindet, die vermutlich als Signalmoleküle für die intrazelluläre Phosphatkonzentration dienen. In Hefe wird die Aufnahme von Phosphat in Abhängigkeit von der zytosolischen Phosphatkonzentration entweder durch Transporter mit hoher Affnität oder durch Transporter mit niedriger Affnität durchgeführt. Während für Homologe der Hochaffnitätstransporter Strukturen verfügbar sind, wurden bisher keine Strukturen von Transportern mit niedriger Affinität gelöst. Interessanterweise besitzen nur die Transporter mit niedriger Affinität eine zusätzliche SPX-Domäne, die nachweislich den Phosphattransport in vivo inhibiert. Wie diese Domäne den Phosphattransport auf mechanistischer Ebene hemmt, ist jedoch noch unbekannt. Im Vergleich zu den zahlreichen Phosphatimportern ist im Genom von S. cerevisiae nur ein einziger bekannter Phosphatexporter kodiert, der Suppressor of Yeast Gpa1 (Syg1). Sequenzanalysen zeigen, dass dieser keine Homologie zu anderen Transportern mit bekannter Struktur aufweist, jedoch ist die Familie der Phosphatexporter in allen Eukaryoten hochkonserviert. Syg1 besitzt ebenfalls eine regulatorische SPX-Domäne, aber wie diese sowohl den Phosphatimport als auch den Phosphatexport in Hefe reguliert, ist noch nicht erforscht. Das Ortholog in Säugetieren heißt Xenotropher und Polytropher Retrovirus Rezeptor 1 (Xpr1) und wurde vor etwa 10 Jahren als Phosphatexporter identifiziert. Im Gegensatz zu Hefe ist Xpr1 das einzige bekannte Säugerprotein, welches eine regulatorische SPX-Domäne besitzt. Frühere Studien haben gezeigt, dass der von Xpr1 vermittelte Phosphat-Efflux von der Bindung von InsPPs an die SPX-Domäne abhängig ist. Mutationen im Xpr1-Gen führen außerdem zu verschiedenen Krankheiten, die alle mit Defekten in der Phosphathomöostase in Verbindung stehen. Des Weiteren wurde festgestellt, dass Xpr1 bei bestimmten Krebsarten überexprimiert wird und es wurde gezeigt, dass die Hemmung oder das Ausschalten von Xpr1 zu toxisch hohen intrazellulären Phosphatspiegeln und anschließendem Zelltod führt, was Xpr1 zu einem interessanten therapeutischen Ziel macht.