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Kinetik des Protonen gekoppelten Elektronentransfers in Enzymkomplexen der Atmungskette

Kinetics of Proton Coupled Electron Transfer Reactions in Enzyme Complexes of the Respiratory Chain

  • Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
  • Proton coupled electron transfer is an essential part of the chemi-osmotic theory. Its description poses a complex experimental challenge due to its transient character. Electrometric measurements are a great help in the acquisition of charge translocation processes. They allow to follow in a time-resolved manner the transport of electrons and protons, respectively. In particular the latter are difficult to detect with other techniques. Potential measurements at a black lipid membrane have been performed for three different enzyme complexes from the respiratory chain: the cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans (COX), the quinol:fumarate reductase from Wolinella succinogenes (QFR) and the bc(1)-complex from Saccharomyces cerevisiae. There are common problems with regard of the experimental strategy for kinetic investigations: the need for a fast and efficient activation of a particular enzyme system starting from a controlled defined state. Therefore, the goal of this work was to establish experimental conditions for electrometric measurements on the bc(1)-complex and the QFR and the continuation on the already implemented system for the COX. Cytochrome c oxidase The electrometric measurements on the COX were pursued based on previous achievements. In particular the charge translocating steps after photoreduction of the fully oxidized state of the enzyme were in the focus of this work. Here, a proton is taken up after heme a is going to be reduced from the excited state of an organometallic ruthenium complex. This behaviour is independent from the heterogeneous starting state. However, it may be influenced by a change of the pH-value. The consequences of a heterogeneous starting state in the O-E transition is discussed in the framework of a sequential reaction model revealing a discrepancy between the electrometric and the spectroscopic data. While the oxidation of Cu(A) proceeds spectroscopically with the reduction of heme a in a single observable phase, a second much slower phase is observed for the proton uptake in the electrometric measurements. This leads to a conflict with a sequential reaction model. The implications of this result are discussed with respect to the nature of the coupling between electron and proton transfer. The kinetics of charge translocation processes have been examined in detail by means of the temperature dependence and the isotope effect for the electron and proton transfer in the O-E transition. The results are compared with the ones for a thermophilic enzyme, i.e. the ba(3)-oxidase from Thermus thermophilus. Quinol:fumarate reductase A caged fumarate has been synthesized with the aim of a fast activation of the QFR. Photolysis of this compound leads to a fast concentration jump of fumarate. The new compound has been characterized to explore the its suitability in measurements with the QFR. The release of fumarate takes place with a time constant of 0,1 ms and it starts the enzymatic reaction of the QFR only after photolysis. However, it was not possible to perform kinetic measurements due to the photochemistry of the metallic cofactors in the QFR. Because the light-induced redox reactions in the QFR are decreasing with increasing wavelengths, the synthesis of a new compound has been proposed that may be photolyzed in the visible spectral range. bc(1)-complex The bc(1)-complex as well can be activated by a ruthenium complex as the COX. Therefore, a dimeric complex and one coupled to cytochrome c were synthesized according to literature data. The compounds were characterized, in particular after light excitation. The bc(1)-complex was reconstituted in proteoliposomes for the electrometric measurements and the starting state was prepared under oxidizing or reducing experimental conditions. Usage of the dimeric ruthenium complex in the electrometric measurements leads to two distinct phases in the photopotential over the membrane. The results were discussed and compared to published data from spectroscopic experiments. A fast electrogenic phase was assigned to electron transfer between heme c(1) and the iron-sulfur cluster of the Rieske protein. A second slower one showed a sensitivity towards antimycin and reflects processes in the Q(i) binding site.

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Metadaten
Author:Christian Bamann
URN:urn:nbn:de:hebis:30-32176
Referee:Klaus Fendler, Bernd Ludwig
Advisor:Klaus Fendler
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2006
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/09/08
Release Date:2006/10/26
Tag:Black Lipid Membrane; Quinon-Fumarat-Reduktase
Cytochrome c oxidase; Ubiquinon-Cytochrome c-Reductase; black lipid membrane; electron transfer; proton transfer
GND Keyword:Cytochromoxidase; Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase; Protonentransfer; Elektronentransfer; Paracoccus denitrificans
Page Number:173
HeBIS-PPN:181997347
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht