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Shih-Ying Chang

• Biological membranes serve as physical barriers in cells and organelles, enabling the maintenance of chemical or ionic gradients that are essential for triggering various integral, peripheral, or lipid-anchored membrane proteins, necessary for their life-essential functions. The study of membrane proteins has unique challenges due to their hydrophobic nature, limited expression levels, and inherent flexibility. Single-particle analysis (SPA) enables the determination of high-resolution three-dimensional structures using minimal amounts of specimen without the need for crystallization. Additionally, cryogenic electron tomography (cryo-ET) and subtomogram averaging (StA) offer the ability to study membrane protein complexes, cellular architecture, and molecular interactions while preserving close-to-life conditions. With ongoing improvements in cryo-EM technologies, obtaining high-resolution structures of membrane proteins in vitro can allow people to understand their mechanisms and functions, and to facilitate the design and optimization of new therapeutic agents. Furthermore, there has been significant growth in the structural characterization of membrane proteins in situ, as studying biomolecules within their physiological context is an ultimate goal in structural biology for a comprehensive understanding of molecular networks in cells. Due to the amphipathic nature of membrane proteins, their production, purification, and isolation pose significant challenges compared to soluble proteins. To maintain the membrane protein fold in an aqueous buffer after disrupting lipid membranes, the use of detergents, amphipols, lipid nanodiscs, saposin-lipoprotein (salipro), styrene-maleic acid co-polymer lipid particles (SMALPS) is common and often essential. A limitation of the membrane-mimetic systems is the absence of an actual lipid bilayer environment. To address this issue, membrane proteins can be reconstituted into liposomes, and this closed membrane environment closely mimics the physiological conditions of the proteins. The use of liposomes for structure determination is expected to significantly expand in the in vitro study of membrane proteins and membrane-associated proteins, particularly for capturing transient complexes in specific functional states. Resolving the structures of membrane proteins in their native cellular context is considered the ideal approach for understanding their functions and associated molecular networks. While single-particle cryo-EM can achieve higher resolution than subtomogram averaging, it often requires at least partial purification of the target molecules from their native environment inside cells and tissues. By combining averaging tools on subvolumes obtained through cryo-ET, structures can currently be determined at resolutions of 10-30 Å. With ongoing advancements and refinements in cryo-ET methodologies, routine high-resolution structure determination in situ is poised to become a valuable tool for both structural and cell biologists in the long run, and the field holds great promise for further expanding our understanding of cellular structures and processes at the molecular level. The main aim of this thesis is to further our knowledge of the structure and function of a small prokaryotic voltage-gated sodium ion channel, NaChBac in liposomes, and a large knob complex found on the surface of Plasmodium falciparum-infected human erythrocyte by cryo-ET and StA. Chapter 2 presents the first StA map of the 120-kDa NaChBac embedded in liposomes under a resting membrane potential at a modest resolution of 16 Å. The approach presented in this study, which can be widely applied to cryo-EM analysis of membrane proteins, with a specific focus on membrane proteins with small soluble domains, lays the foundation for cryo-ET and StA of integral or peripheral membrane proteins whose functions are affected by transmembrane electrochemical gradients and/or membrane curvatures. Chapter 3 shows the first cryo-EM structure of the supramolecular knob complex in P. falciparum-infected human erythrocyte. While a previous study provided an overall architectural view of knobs using negative stain tomography, the in situ structure bridges this gap, guiding future investigations into the molecular composition and the role of these native knobs in Plasmodium infection and immunity. This thesis opens up several promising lines for future studies of membrane proteins in vitro and in situ, where other membrane proteins can be studied in physiologically relevant environments. Already with the present generation of cryo-EM hardware and software, this thesis represents pioneering research in the field of membrane protein structural biology.
• Biologische Membranen dienen als physische Barrieren in Zellen und Organellen und ermöglichen die Aufrechterhaltung chemischer oder ionischer Gradienten, die für das Auslösen verschiedener integraler, peripherer oder lipidverankerter Membranproteine erforderlich sind, die für ihre lebensnotwendigen Funktionen notwendig sind. Die Untersuchung von Membranproteinen birgt einzigartige Herausforderungen aufgrund ihrer hydrophoben Natur, begrenzter Expressionsniveaus und inhärenten Flexibilität. Die Einzelpartikelanalyse (SPA) ermöglicht die Bestimmung hochauflösender dreidimensionaler Strukturen unter Verwendung minimaler Probenmengen, ohne dass eine Kristallisation erforderlich ist. Darüber hinaus bieten die kryogene Elektronentomographie (cryo-ET) und die Subtomogramm-Mittelung (StA) die Möglichkeit, Membranprotein-Komplexe, zelluläre Architektur und molekulare Interaktionen zu untersuchen und gleichzeitig lebensnahe Bedingungen zu erhalten. Mit den laufenden Verbesserungen in den Cryo-EM-Technologien können hochauflösende Strukturen von Membranproteinen in vitro dazu beitragen, ihre Mechanismen und Funktionen zu verstehen und die Gestaltung und Optimierung neuer therapeutischer Wirkstoffe zu erleichtern. Darüber hinaus hat es eine signifikante Zunahme in der strukturellen Charakterisierung von Membranproteinen in situ gegeben, da das Studium von Biomolekülen in ihrem physiologischen Kontext ein ultimatives Ziel in der Strukturbiologie ist, um ein umfassendes Verständnis molekularer Netzwerke in Zellen zu erlangen. Aufgrund der amphiphilen Natur von Membranproteinen stellen ihre Herstellung, Reinigung und Isolierung im Vergleich zu löslichen Proteinen erhebliche Herausforderungen dar. Um die Faltung von Membranproteinen in einem wässrigen Puffer nach der Auflösung von Lipidmembranen aufrechtzuerhalten, ist die Verwendung von Detergenzien, Amphipolen, Lipidnanoscheiben, Saposin-Lipoprotein (Salipro) und Styrol-Maleinsäure-Copolymer-Lipidpartikeln (SMALPS) üblich und oft unerlässlich. Eine Einschränkung der Membran-Mimetik-Systeme ist das Fehlen einer tatsächlichen Lipiddoppelschicht-Umgebung. Um dieses Problem zu lösen, können Membranproteine in Liposomen rekonstituiert werden, wodurch eine geschlossene Membranumgebung geschaffen wird, die die physiologischen Bedingungen der Proteine eng nachahmt. Die Verwendung von Liposomen zur Bestimmung von Strukturen soll sich in der in vitro-Untersuchung von Membranproteinen und membrangebundenen Proteinen erheblich ausweiten, insbesondere zur Erfassung transienter Komplexe in bestimmten funktionellen Zuständen. Die Auflösung der Strukturen von Membranproteinen in ihrem nativen zellulären Kontext gilt als idealer Ansatz, um ihre Funktionen und assoziierten molekularen Netzwerke zu verstehen. Obwohl die Einzelpartikel-Cryo-EM eine höhere Auflösung als die Subtomogramm-Mittelung erreichen kann, erfordert sie oft zumindest eine teilweise Reinigung der Zielmoleküle aus ihrer nativen Umgebung innerhalb von Zellen und Geweben. Durch die Kombination von Mittelungswerkzeugen auf Subvolumina, die durch Cryo-ET erhalten wurden, können Strukturen derzeit mit Auflösungen von 10-30 Å bestimmt werden. Mit den laufenden Fortschritten und Verfeinerungen in den Cryo-ET-Methoden wird die routinemäßige hochauflösende Strukturbestimmung in situ langfristig zu einem wertvollen Werkzeug für Struktur- und Zellbiologen werden, und das Feld verspricht, unser Verständnis zellulärer Strukturen und Prozesse auf molekularer Ebene weiter auszudehnen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, unser Wissen über die Struktur und Funktion eines kleinen prokaryotischen spannungsgesteuerten Natriumionenkanals, NaChBac in Liposomen, und eines großen Knopfkomplexes auf der Oberfläche von Plasmodium falciparum-infizierten menschlichen Erythrozyten durch Cryo-ET und StA weiter zu vertiefen. Kapitel 2 präsentiert die erste StA-Karte des in Liposomen eingebetteten 120-kDa NaChBac bei einem Ruhepotenzial der Membran mit einer bescheidenen Auflösung von 16 Å. Der in dieser Studie vorgestellte Ansatz, der auf die Cryo-EM-Analyse von Membranproteinen mit einem speziellen Fokus auf Membranproteine mit kleinen löslichen Domänen abzielt, legt den Grundstein für Cryo-ET und StA von integralen oder peripheren Membranproteinen, deren Funktionen durch transmembranöse elektrochemische Gradienten und/oder Membrankrümmungen beeinflusst werden. Kapitel 3 zeigt die erste Cryo-EM-Struktur des supramolekularen Knopfkomplexes in P. falciparum-infizierten menschlichen Erythrozyten. Während eine frühere Studie eine allgemeine architektonische Ansicht von Knöpfen unter Verwendung von Negativfärbetomographie lieferte, überbrückt die in situ-Struktur diese Lücke und leitet zukünftige Untersuchungen zur molekularen Zusammensetzung und zur Rolle dieser nativen Knöpfe bei der Plasmodium-Infektion und Immunität. Diese Arbeit eröffnet mehrere vielversprechende Ansätze für zukünftige Studien von Membranproteinen in vitro und in situ, wo andere Membranproteine in physiologisch relevanten Umgebungen untersucht werden können. Bereits mit der aktuellen Generation von Cryo-EM-Hardware und -Software repräsentiert diese Arbeit wegweisende Forschung im Bereich der strukturellen Membranproteinbiologie.