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John Fernando Garces Daza

• Microbes are the most diverse living organisms on Earth, with various metabolic adaptations that allow them to live in different conditions and produce compounds with different chemical complexity. Microbial biotechnology exploits the metabolic diversity of microorganisms to manufacture products for different industries. Today, the chemical industry is a significant energy consumer and carbon dioxide emitter, with processes that harm natural ecosystems, like the extraction of medium-chain fatty acids (MCFAs). MCFAs are used as precursors for biofuels, volatile esters, surfactants, or polymers in materials with enhanced properties. However, their current extraction process uses large, non-sustainable monocultures of coconut and palm trees. Therefore, the microbial production of MCFAs can help reduce the current environmental impact of obtaining these products and their derivatives. In nature, fatty acids are mostly produced via fatty acid biosynthesis (FAB). However, the reverse β-oxidation (rBOX) is a more energy-efficient pathway compared to FAB. The rBOX pathway consists of four reactions, which result in the elongation of an acyl-CoA molecule by two carbon units from acetyl-CoA in each cycle. In this work we used Saccharomyces cerevisiae, an organism with a high tolerance towards toxic compounds, as the expression host of the rBOX pathway to produce MCFAs and medium-chain fatty alcohols (MCFOHs). In the first part of this work, we expanded the length of the products from expressing the rBOX in the cytosol and increased the MCFAs titres. First, we deleted the major glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPD2). This resulted in a platform strain with significantly reduced glycerol fermentation and increased rBOX pathway activity, probably due to an increased availability of NADH. Then, we tested different combinations of rBOX enzymes to increase the length and titres of MCFA. Expressing the thiolase CnbktB and β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase CnpaaH1 from Cupriavidus necator, Cacrt from Clostridium acetobutylicum and the trans-enoyl-CoA reductase Tdter (Treponema denticola) resulted in hexanoic acid as the main product. Expressing Cncrt2 (C. necator) or YlECH (Y. lipolytica) as enoyl-CoA hydratases resulted in octanoic acid as the main product. Then, we integrated the octanoic (Cncrt2 or YlECH) and the hexanoic acid (Cacrt)-producing variants in the genome of the platform strain and we achieved titers of ≈75 mg/L (hexanoic acid) and ≈ 60 mg/L (octanoic acid) when growing these strains in a complex, highly buffered medium. These are the highest titers of octanoic and hexanoic acid obtained in S. cerevisiae with the rBOX. Additionally, we deleted TES1 and FAA2 to prevent competition for butyryl-CoA and degradation of the produced fatty acids, respectively. However, these deletions did not improve MCFA titers. In addition, we tested two dual acyl-CoA reductase/alcohol dehydrogenases (ACR/ADH), CaadhE2 from C. acetobutylicum and the putative ACR/ADH EceutE from Escherichia coli, in an octanoyl-CoA-producing strain to produce MCFOH. As a result, we produced 1-hexanol and 1-octanol for the first time in S. cerevisiae with these two enzymes. Nonetheless, the titres were low (<10 mg/L and <2 mg/L, respectively), and four-carbon 1-butanol was the main product in both cases (>80 mg/L). This showed the preference of these two enzymes for butyryl-CoA. In the second part of this work, we expressed the rBOX in the mitochondria of S. cerevisiae to benefit from the high levels of acetyl-CoA and the reducing environment in that organelle. First, in an adh-deficient strain, we mutated MTH1, a transcription factor regulating the expression of hexose transporters, and deleted GPD2. This resulted in a strain with a reduced Crabtree effect and, therefore, an increased carbon flux to the mitochondria. We partially validated the increased flux to the mitochondria by expressing the ethanol-acetyltransferase EAT1 from Kluyveromyces marxianus in this organelle. This resulted in a higher isoamyl acetate production in the MTH1-mutant strain. Isoamyl acetate is synthesised by Eat1 from acetyl-CoA and isoamyl alcohol, a product of the metabolism of amino acids in the mitochondria. Then, we targeted different butyryl-CoA-producing rBOX variants to the mitochondria, and we used the production of 1-butanol and butyric acid as a proof-of-concept. The strong expression of all the enzymes was toxic for the cell, and the highest butyric acid titres (≈ 50 mg/L) in the mitochondria from the rBOX were obtained from the weak expression of the pathway. The highest 1-butanol titers (≈ 5 mg/L) were obtained with the downregulation of the mitochondrial NADH-oxidase NDI1. However, this downregulation led to a non-desirable petite phenotype. In summary, we produced hexanoic and octanoic acid for the first time in S. cerevisiae using the rBOX and achieved the highest reported titers of hexanoic and octanoic acid so far using this pathway in S. cerevisiae. In addition, we successfully compartmentalised the rBOX in the mitochondria. However, competing reactions, some of them essential for the viability of the cell, limit the use of this organelle for the rBOX.
• Mikroben sind die vielfältigsten lebenden Organismen auf der Erde und verfügen über verschiedene Stoffwechselanpassungen, die es ihnen ermöglichen, unter unterschiedlichen Bedingungen zu leben und diverse Verbindungen von variierender chemischer Komplexität zu produzieren. In der mikrobiellen Biotechnologie wird die Stoffwechselvielfalt von Mikroorganismen genutzt, um Produkte für verschiedene Industrien herzustellen. Heutzutage ist die chemische Industrie ein bedeutender Energieverbraucher und Kohlendioxidemittent, mit Prozessen, die natürliche Ökosysteme schädigen, wie etwa der Gewinnung mittelkettiger Fettsäuren (MCFAs). MCFAs werden als Vorläufer für Biokraftstoffe, flüchtige Ester, Tenside oder Polymere in Materialien zur Verbesserung ihrer Eigenschaften verwendet. Der aktuell verwendete Extraktionsprozess nutzt jedoch große, nicht nachhaltige Monokulturen von Kokos- und Ölpalmen. Daher kann die mikrobielle Produktion von MCFAs dazu beitragen, die Umweltauswirkungen der Gewinnung dieser Produkte und ihrer Derivate zu verringern. In der Natur werden Fettsäuren größtenteils durch Fettsäurebiosynthese (FAB) hergestellt. Allerdings ist die umgekehrte β-Oxidation (rBOX) im Vergleich zu FAB ein energieeffizienterer Stoffwechselweg. Der rBOX-Weg besteht aus vier Reaktionen, die in jedem Zyklus zur Verlängerung eines Acyl-CoA-Moleküls um zwei Kohlenstoffeinheiten von Acetyl-CoA führen. In dieser Arbeit wurde Saccharomyces cerevisiae, eine Mikrobemit einer hohen Toleranz gegenüber toxischen Verbindungen, als Expressionswirt des rBOX-Wegs zur Produktion von MCFA und mittelkettigen Fettalkoholen verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Länge der Produkte aus der Expression der rBOX im Zytosol verlängert, und die MCFAs-Titer erhöht. Zunächst wurde die wichtigste Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD2) in einem adh-defizienten Stamm deletiert. Dies führte zu einem Plattformstamm mit deutlich reduzierter Glycerinfermentation und erhöhter Aktivität des rBOX-Wegs, wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Verfügbarkeit von NADH. Anschließend wurden verschiedene Kombinationen von rBOX-Enzymen zur Herstellung von MCFAs getestet. Die Expression der Thiolase CnbktB und der β-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase CnpaaH1 aus Cupriavidus necator, Cacrt aus Clostridium acetobutylicum und der trans-Enoyl-CoA-Reduktase Tdter (Treponema denticola) führte zu Hexansäure als Hauptprodukt. Die Expression von Cncrt2 (C. necator) oder YlECH (Yarrowia lipolytica) als Enoyl-CoA-Hydratasen führte zu Octansäure als Hauptprodukt. Anschließend wurden die Octansäure (Cncrt2 oder YlECH) und die Hexansäure (Cacrt) produzierenden Varianten in das Genom des Plattformstamms integriert. Beim Züchten dieser Stämme in einem komplexen, stark gepufferten Medium wurden Titer von ≈75 mg/L (Hexansäure) und ≈ 60 mg/L (Octansäure) erreicht. Dies sind die höchsten Titer an Octan- und Hexansäure, die in S. cerevisiae mit der rBOX bis jetzt erzielt wurden. Darüber hinaus wurden TES1 und FAA2 deletiert, um die Konkurrenz um Butyryl-CoA bzw. den Abbau der produzierten Fettsäuren zu verhindern. Dennoch wurden die MCFA-Titer durch diese Deletionen nicht verbessert. Darüber hinaus wurden zwei duale Acyl-CoA-Reduktase/Alkohol-Dehydrogenasen (ACR/ADH), CaadhE2 aus C. acetobutylicum und das mutmaßliche ACR/ADH EceutE aus Escherichia coli, in einem Octanoyl-CoA-produzierenden Stamm getestet, um MCFOH zu produzieren. Mit diesen beiden Enzymen wurden erstmals in S. cerevisiae 1-Hexanol und 1-Octanol hergestellt. Dennoch waren die Titer niedrig (<10 mg/L bzw. <2 mg/L) und das Vier-Kohlenstoff-Molekül 1-Butanol war in beiden Fällen das Hauptprodukt (>80 mg/L). Dies zeigte die Affinität dieser beiden Enzyme zu Butyryl-CoA. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die rBOX in den Mitochondrien von S. cerevisiae exprimiert, um von den hohen Acetyl-CoA-Werten und der reduzierenden Umgebung in diesem Organell zu profitieren. Zunächst wurde MTH1, ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von Hexosetransportern reguliert, mutiert und GPD2 in einem adh-defizienten Stamm deletiert. Dies führte zu einem Stamm mit einem verringerten Crabtree-Effekt und damit einem erhöhten Kohlenstofffluss zu den Mitochondrien. Der erhöhte Fluss zu den Mitochondrien wurde teilweise durch die Expression der Ethanol-Acetyltransferase EAT1 aus Kluyveromyces marxianus in den Mitochondrien bestätigt. Dies führte zu einer höheren Isoamylacetat Produktion im MTH1-Mutantenstamm. Isoamylacetat wird von Eat1 aus Acetyl-CoA und Isoamylalkohol synthetisiert, einem Produkt des Aminosäurestoffwechsels in den Mitochondrien. Anschließend wurden verschiedene Butyryl-CoA-produzierende rBOX-Varianten in den Mitochondrien gezielt eingesetzt und die Produktion von 1-Butanol und Buttersäure als Proof-of-Concept genutzt. Die starke Expression aller Enzyme war toxisch für die Zelle, und die höchsten Buttersäuretiter (≈ 50 mg/L) in den Mitochondrien aus der rBOX wurden durch die schwache Expression des Stoffwechselwegs erhalten. Die höchsten 1-Butanol-Titer (≈ 5 mg/L) wurden mit der Herunterregulierung der mitochondrialen NADH-Oxidase NDI1 erhalten. Diese Herunterregulierung führte jedoch zu einem unerwünschten Petite-Phänotyp. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Octansäure zum ersten Mal in S. cerevisiae unter Verwendung der rBOX hergestellt wurde und die höchsten, bis jetzt festgestellten Titer an Hexan- und Octansäure auf diesem Weg in S. cerevisiae erreicht wurden. Darüber hinaus konnte die rBOX erfolgreich in den Mitochondrien kompartimentiert werden. Kompetente Reaktionen, von denen einige für die Lebensfähigkeit der Zelle unerlässlich sind, schränken jedoch die Verwendung dieses Organells für den rBOX-Weg ein.