Open Access

Parimala Sonika Godavarthy

• The endosteal bone marrow niche and vascular endothelial cells provide sanctuaries to leukemic cells. In murine chronic myeloid leukemia (CML) CD44 on leukemia cells and E-selectin on bone marrow endothelium are essential mediators for the engraftment of leukemic stem cells (LSC). We hypothesized that non-adhesion of CML-initiating cells to E-selectin on the bone marrow endothelium may lead to superior eradication of LSC in CML after treatment with imatinib than imatinib alone. Indeed, here we show that treatment with the E-selectin inhibitor GMI-1271 in combination with imatinib prolongs survival of mice with CML via decreased contact time of leukemia cells with bone marrow endothelium. Non-adhesion of BCR-ABL1+ cells leads to an increase of cell cycle progression and an increase of expression of the hematopoietic transcription factor and protooncogene Scl/Tal1 in leukemia-initiating cells (LIC). We implicate SCL/TAL1 as indirect phosphorylation target of BCR-ABL1 and as a negative transcriptional regulator of CD44 expression. We show that increased SCL/TAL1 expression is associated with improved outcome in human CML. These data demonstrate the BCR-ABL1-specific, cell-intrinsic pathways leading to altered interactions with the vascular niche via the modulation of adhesion molecules - a strategy therapeutically exploitable in future.
• Das Knochenmarksmikromilieu (KMM) besteht aus unterschiedlichsten Nischenzellen, darunter mesenchymale Stromazellen (MSZ), Osteoblasten, Zellen des Nervensystems, persivaskuläre und endotheliale Zellen, Adipozyten und viele weitere. Diese liefern unter anderem Signale zur Regulation und Unterstützung der Produktion und Differenzierung von verschiedenen Blutzellen und stellen damit die Aufrechterhaltung der Homöostase sicher. Veränderungen in der Interaktion zwischen hämatopoetischen Zellen und dem Mikromilieu kann die Entstehung von hämatologischen Erkrankungen befördern und verursachen. Es ist daher bedeutsam, die komplexen Veränderungen im Progress von gesunder zu maligner Nische zu verstehen und diese Erkenntnisse zur Entwicklung neuartiger Therapien zu verwenden. Im Fall von Leukämien bietet das Knochenmarksmikromilieu, insbesondere die enossale Nische, einen Zufluchtsort für leukämische Zellen, wodurch leukämische Stammzellen (LSZ) vor Chemotherapie geschützt werden. Bei Erkrankungen an CML führt Imatinibmesilat als Standardmedikament in der Chemotherapie dieser Leukämieform in den meiste Fällen zu einer Remission der Erkrankung. Allerdings entwickeln manche Patienten ein Rezidiv, möglicherweise durch ein von dem KMM unterstützten Fortbestehen leukämischer Stammzellen. In der vaskulären Nische exprimieren endotheliale Zellen E-Selectin, welches bekanntermaßen mit Liganden auf leukämischen Zellen interagiert. So interagiert E-Selectin unter anderen mit CD44, einem Adhäsionsmolekül, welches üblicherweise in CML-LSZ überexprimiert wird. Experimente an Mäusen konnten die wichtige Rolle von E-Selectin und CD44 für das Auffinden der Knochenmarksnische („Homing“) und Einnisten von LSZ bei CML in vivo zeigen; die Abwesenheit von CD44 oder E-Selectin verlängerte das Überleben der Mäuse. Es ist bekannt, dass E-Selectin eine Rolle in der Metastasierung von Brutkrebs spielt und im Fall von multiplem Myelom und AML auf maligne Zellen in vivo protektiv wirkt. In verschiedenen Pathologien wie dem multiplen Myelom bot E-Selectin Resistenz gegen multiple Myelomzellen, und die Hemmung des E-Selectin-Rezeptors und des Liganden verbesserte das Überleben von Mäusen. Andererseits ist auch bekannt, dass Brustkrebszellen von E-Selectin abhängen, um zum Knochen zu gelangen. Unserer Hypothese nach kann das gezielte Eingreifen in das Mikromilieu durch die Blockade der Interaktion von CML-initiierenden Zellen mit E-Selectin zusätzlich zur Therapie mit Imatinib das Überleben verbessern. Die Behandlung mit GMI-1271, einem niedermolekularen Antagonisten von E-Selectin führte zur verringerten Adhäsion von CMLZelllinien und primären humanen CML-Zellen an E-Selectin in vivo und in vitro. Die Behandlung von an CML erkrankten Mäusen mit GMI-1271 in Kombination mit Imatinib verlängerte das Überleben der Mäuse, verglichen zur alleinigen Standardtherapie mit Imatinib, und senkte deren Tumorlast. Wir konnten beobachten, dass sich CML-initiierende Zellen in größerem Abstand vom Endothel aufhalten, wenn eine Therapie mit GMI-1271 gemeinsam mit Imatinib, im Gegensatz zur alleinigen Therapie mit Imatinib, gewählt wurde. Dies legt nahe, dass die Lokalisation der CML-initiierenden Zellen im Knochenmarksmikromilieu durch die Kombinationsbehandlung beeinflusst wurde. Es wurde zuvor gezeigt, dass Endothelzellen Ruhe induzieren können, und da Imatinib nur auf die zyklischen Zellen abzielen kann, deuten unsere Daten darauf hin, dass eine Nichtbindung an Endothel und daher eine Lokalisierung von Leukämiezellen weiter vom Endothel entfernt möglicherweise zu einer besseren Zielausrichtung von LIC mit Imatinib geführt hat. Verschiedene in vitro Adhäsionsuntersuchungen bestätigten, dass die Unterdrückung der Interaktion von CML-Zellen mit E-Selectin durch GMI-1271 zu einer erhöhten Expression des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors Scl/Tal1 auf mRNA- und Proteinebene führte. Die erhöhte Scl/Tal1-Expression war spezifisch für die Nicht-Adhäsion an E-Selectin. CD44, ein Adhäsionsmolekül, wird bekanntermaßen in BCR-ABL1+ Zellen überexprimiert. Dieser Zusammenhang brachte uns zu unserer Hypothese, dass Scl/Tal1 eine Rolle in der Kontrolle der CD44-Expression spielen könnte. Diverse Knockdown-Experimente an SCL/TAL1 in K562, einer CML-Zelllinie, führten zu einer erhöhten Expression von CD44. Massenspektrometrische Analysen bestätigten, dass der Knockdown von SCL/TAL1 zur Hochregulation von CD44 führte. Unsere Daten zeigen eine negative Korrelation von SCL/TAL1 und CD44. Darüber hinaus zeigten ChIP-Experimente, dass Scl/Tal1 an das regulatorische Element von CD44 bindet und dadurch dessen Expression negativ beeinflusst. Die Behandlung mit Imatinib verstärkt diese Bindung an das regulatorische Element. Eine Überexpression in vivo von SCL/TAL1 in BCR-ABL1-Zellen führte zu einer Verlängerung des Überlebens der untersuchten Mäuse. Unsere Daten legen darüber hinaus nahe, dass die Kombinationstherapie durch GMI-1271 und Imatinib, im Vergleich zur alleinigen Therapie mit GMI-1271 oder Imatinib, die Expression von CD44 reduziert. Folglich verändert die Unterdrückung der Interaktion von E-Selectin und CML-LSZ durch GMI-1271 und Imatinib die Lokalisation der CML-initiierenden Zellen relativ zum Endothel und verlängert das Überleben in vivo. Die Behandlung mit GMI-1271 löst molekulare Veränderungen aus, erhöht Scl/Tal1 und damit die Scl1/Tal1-abhängige CD44-Regulation. Darüber hinaus ist bekannt, dass E-Selectin den Zellzyklus von HSZ beeinflusst, indem es die Proliferation während der Hämatopoese auch im gesunden Organismus unterstützt. Daher erhöht die sowohl die alleinige Behandlung mit GMI-1271 als auch die Kombinationstherapie von Imatinib und GMI-1271 die G2-S-M-Phase im Zellzyklus nichtadhärenter Zellen in vitro und in vivo. Dies legt nahe, dass die Blockade der Interaktion mit E-Selectin den Zellzyklus bei CML im Gegensatz zu HSZ erhöht. Dieser beschleunigte Zellzyklus war mit Veränderungen an Zellzyklusregulatoren verbunden, so wurde sowohl eine erhöhte Aktivität von CDK4 als auch eine verringerte Expression von p16 beobachtet. Wir konnten Veränderungen in sowohl non-adhärenten als auch adhärenten Zellen nach Bindung an E-Selectin aufdecken, während Veränderungen des Zellzyklus und der CD44-Expression hauptsächlich in non-adhärenten Zellen zu sehen sind. Diese Daten liefern vorläufige Ergebnisse, dass sich nicht adhärente Zellen und adhärente Zellen mechanistisch unterscheiden können und dass die Adhäsion zwischen Leukämie-Stammzellen und der Nische eine Rolle bei der Chemoprotektion spielen kann. BCR-ABL1 ist eine konstitutiv aktives Tyrosinkinase, die diverse nachgelagerte Zielproteine phosphoryliert. Wir konnten zeigen, dass die Phosphorylierung von SCL/TAL1 durch BCR-ABL1 über den Phosphoinositid-3-Kinase-Signalweg gesteuert wird. Zusammen betrachtet, reduziert die Blockade von BCR-ABL1 durch Imatinib die Phophorylierung von AKT und damit von Phospho-SCL/TAL1, steigert dessen Aktivität und lässt damit SCL/TAL1 vermehrt an das regulatorische Element von CD44 binden, wodurch dessen Aktivität wiederum negativ beeinflusst wird. Diese Erkenntnis stellt somit eine Verbindung zum bisher unbekannten Mechanismus der Phosphorylierung von SCL/TAL1 durch BCR-ABL1 da. Wie E-Selectin wurde der Chemokinrezeptor CXCR4 vorwiegend in HSCs und auch in CML untersucht. CML-Zellen, die CXCR4 exprimieren, weisen eine bessere Migration und Adhäsion an der Nische auf. CML Studien, in denen CXCR4 durch AMD3100 inhibiert wurde, haben erfolgreich gezeigt, dass diese Inhibition die protektive Natur des Stromas überwindet Es ist bekannt, dass GMI-1359, ein Nachfolger von GMI-1271, E-Selectin und CXCR4 in Kombination angreift. Die zweifache Blockade von sowohl E-Selectin als auch CXCR4, einem mit CML-LSZ in Verbindung stehenden Chemokin-Rezeptor, durch GMI-1359 zeigte einen Trend in Richtung verlängerten Überlebens in vivo. Humane Patientendaten zeigen eine negative Korrelation von SCL/TAL1 und CD44 in Fällen von CML. Patienten mit einer hohen Expression von SCL/TAL1 zeigen ein besseres Rezidivfreies Überleben. Zusammenfassend lässt sich zeigen, dass E-Selectin in der vaskulären Nische den Verbleib von LSZ in der Ruhephase ermöglicht und daher eine Behandlung mit GMI-1271 die Dislokation aus dieser Nische und einen beschleunigten Zellzyklus bewirkt. Dies erhöht die Anfälligkeit gegenüber Imatinib. Die Regulation der CD44-Expression durch SCL/TAL1, den AKT-Signalweg und ein Onkogen lassen molekulare Veränderungen in leukämischen Stammzellen vermuten, die eine Loslösung aus der Nische bewirken. Unsere Arbeit konnte molekulare Signale, welche die Interaktion zwischen leukämischen Zellen und dem Mikromilieu regulieren, aufzeigen und Erkenntnisse liefern, wie eine Beeinflussung der Nische sowohl die Entstehung als auch die Therapie von malignen Erkrankungen unterstützen kann.