Open Access

Nathalie Meiser

• N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant and well understood modification in eukaryotic mRNA and was first identified in polyadenylated parts of the mRNA.The distinct distribution of m6A in the transcriptome with special enrichment in long internal exons, 39UTRs and around stop codons was uncovered by early biochemical work and later on antibody based sequencing techniques. The so called m6A writer, reader and eraser machinery is responsible for the dynamic and with that regulatory nature of the m6A modification. As m6A writer, the human N6-methyltransferase complex (MTC) cotranscriptionally methylates the central adenine within a RRACH (preferably GGACU) sequence context to form m6A in the nascent RNA chain.9–15 The catalytic core of the complex is formed by the two proteins METTL3 and METTL14, with the active site located in the methyltransferase domain (MTD) of METTL3.16–18 The DPPW motif near the methyl donor S-adenosylmethionine (SAM) binding site in this MTD was postulated to bind the target adenine during catalysis. Moreover, a positively charged groove in the METTL3-METTL14 interface, the C-terminal RGG domain in METTL14 and the zinc finger motifs in METTL3 were identified as important domains for RNA binding. However, to date there are no full-length or substrate-RNA-bound structures of the catalytic METTL3-METTL14 complex. In addition, a set of accessory proteins assembles to the METTL3-METTL14 heterodimer to form the full MTC, mediated by WTAP that firmly binds to the N-terminal leader helix in METTL3.20 WTAP was shown to locate the whole complex to the nuclear speckles and can modulate m6A deposition to specific sites in the RNA. Moreover, WTAP acts as binding platform for other accessory proteins including VIRMA, RBM15, ZC3H13 and HAKAI that are mostly identified to mediate position specific methylation. For example, RBM15 was shown to mediates region-selective methylation in a WTAP dependent manner, directing specificity towards U-rich sequences. The observed specificity of the methyltransferase complex to methylate only site specific DRACH sequenced is still poorly understood. Some possible modulators like the role of the accessory proteins are under investigation, however, the structural context of the RNA methylation sites or a structural preference of the complex have been mainly neglected so far. Moreover, the structural dynamics of this methylation process still remain elusive. This thesis contributes to the afore-mentioned aspects by analysis of the methylation process regarding RNA structure sensitivity with enzymatic activity assays and its dynamic nature by implementing a smFRET approach. We hypothesized the target RNA secondary structure to be an additional important modulator of methylation efficiency, based on the RNA binding elements of the complex (positively charged binding groove, zinc finger domain, RGG domain) and the supposed target adenine binding in the active site. Here, we postulated the possibility for a flipped-out adenine to be of special relevance, which is closely related to the local stability of the target adenine containing structure. Moreover, efficient binding of the protein complex to the RNA should require the ability to anchor the RNA on both sides of the target sequence.
• N6-Methyladenosin (m6A) ist die häufigste Modifikation in eukaryotischer mRNA. Der menschliche N6-Methyltransferasekomplex (MTC) methyliert cotranskriptionell das zentrale Adenin innerhalb eines RRACH- (vorzugsweise GGACU-) Sequenzkontextes in der naszierenden RNA. Der katalytische Kern dieses Komplexes wird von den beiden Proteinen METTL3 und METTL14 gebildet, wobei sich das aktive Zentrum in der Methyltransferase-Domäne (MTD) von METTL3 befindet. Des Weiteren bindet eine Reihe weiterer Proteine (WTAP, VIRMA, RBM15, ZC3H13 und HAKAI) an das zentrale METTL3-METTL14-Heterodimer, wobei WTAP als Bindeplattform fungiert. Im ersten Kapitel dieser Arbeit wurde der Einfluss der Sekundärstruktur der Substrat-RNA auf die Methylierungseffizienz des METTL3/METTL14-Komplexes analysiert. Dies wurde durch enzymatische Aktivitätstests an Substrat-RNAs mit unterschiedlichen strukturellen Kontexten untersucht. Die höchste Methylierungseffizienz wurde dabei für eine unstrukturierte RNA beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine wenig stabile Zielstruktur und die Möglichkeit der Proteinbindung auf beiden Seiten der Zielsequenz für eine effiziente Katalyse besonders wichtig sind. Veränderungen der GGACU-Sequenz innerhalb des RRACH-Sequenzkontexts verringerten die Methylierungsausbeute, wobei die zentrale GAC-Sequenz von besonderer Bedeutung war. Wir beobachteten einen stärkeren Einfluss des RRACH-Sequenzkontextes auf die Methylierungseffizienz in einer haarnadelstrukturierten RNA als für die unstrukturierte RNA. Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse einen Einfluss der RNA-Sekundärstruktur und der Zielsequenz auf die Methylierungseffizienz des METTL3/METTL14-Komplexes mit ähnlich starker Ausprägung in vitro. Um einen Einblick in den Einfluss der einzelnen METTL3/METTL14-Proteindomänen auf die RNA-Katalyse zu erhalten, wurden sechs verschiedene verkürzte Proteinkomplexe exprimiert und aufgereinigt. Die Verkürzung der Proteine konzentrierte sich hauptsächlich auf die (postulierten) RNA-Bindungsdomänen des Kernkomplexes. Die Methylierungsaktivität aller Komplexe mit fehlenden RNA-Bindedomänen war deutlich reduziert, was fast immer mit einer verringerten RNA-Bindeeigenschaft einherging und damit diese Domänen wichtig für die Katalyse macht. Es wurde gezeigt, dass die aus zwei einzelnen Zinkfingern bestehende Zinkfingerdomäne (ZFD) in METTL3 für die Katalyse in voller Länge vorhanden sein muss, während ein einzelner Zinkfinger für die RNA-Bindung ausreicht. Bei weiteren Experimenten mit einer haarnadelstrukturierten RNA wurde die bereits beschriebene RNA-Strukturabhängigkeit des Methylierungsprozesses noch einmal bestätigt. Es wurde darauf geschlossen, dass die katalytische RNA-Bindung vermutlich mit präferierter Orientierung passiert und die allgemeine RNA-Bindung über die RGG-Domäne in METTL14 auf der einen und die ZFD in METTL3 auf der anderen Seite der Zielsequenz vermittelt wird. Die eigentliche Sequenzspezifität wird wahrscheinlich erst bei der Bindung im aktiven Zentrum relevant. In den Ergebnissen der zuvor beschriebenen Experimente wurde ein besonderes Verhalten des Komplexes ohne N-terminale Domäne (NTD) in METTL3 beobachtet. Hier wurde im Gegensatz zu den anderen verkürzten Konstrukten eine erhöhte Methylierungseffizienz auf der unstrukturierten RNA festgestellt. Zudem konnte hier fast kein Einfluss der RNA-Struktur auf die Methylierungsausbeute beobachtet werden. Da dieser Bereich in METTL3 die Bindungsstelle für WTAP enthält, wurden die Experimente mit dem erweiterten Komplex (METTL3/METTL14/WATP) wiederholt. Die Ergebnisse zeigten eine deutlich reduzierte Methylierungsaktivität auf strukturierten RNAs für den Komplex mit WTAP im Vergleich zu dem METTL3/METTL14-Komplex. Das zeigt, dass die NTD in METTL3 eine besondere Rolle bei dem Einfluss der RNA-Sekundärstruktur auf die Methylierungsaktivität des Komplexes spielt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Dynamik des MTC während der Katalyse eingehend untersucht. Zunächst wurde ein smFRET Mikroskop mit individueller Software aufgebaut. Die folgenden Messungen mit einer fluoreszent markierten RNA und dem MTC ergaben deutliche Unterschiede zwischen dem katalytisch kompetenten und postkatalytischen Komplex. Es wurden vier unterschiedliche Zustände und Übergänge zwischen diesen detektiert. Dabei wurde eine Kontraktion der RNA Konformation während der Proteinbindung und Katalyse beobachtet. Der kontrahierteste Zustand der RNA war für den katalytisch kompetenten Komplex deutlich stärker populiert als für den postkatalytischen Komplex. Dieser Unterschied wurde durch Experimente mit einer abasischen RNA auf die Anwesenheit von Substrat- oder Produktnukleotid und nicht auf die Kofaktoren SAM oder SAH zurückgeführt. Die gleichen Messungen wurden mit dem METTL3/METTL14/WTAP Komplex wiederholt und es zeigte sich ein ähnliches Muster. Allerdings waren die Populationen generell eher zum kontrahiertesten Zustand verschoben und die beobachteten Dynamiken in Form von Übergängen zwischen den Zuständen nahmen zu.