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Synthese und Evaluierung RNA-spaltender Guanidinanaloga und ihrer PNA-Konjugate

  • Künstliche Ribonucleasen, die sequenzspezifisch und effizient die Spaltung von RNA-Phosphordiesterbindungen katalysieren, könnten potenziell nicht nur als biochemische Werkzeuge dienen, sondern auch als Wirkstoffe gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, bei denen mRNA oder miRNA involviert sind, eine wichtige Rolle spielen. Obwohl in den letzten beiden Jahrzehnten zahlreiche sequenzspezifische RNA-Spalter entwickelt wurden, bleibt die Spaltaktivität dieser Verbindungen nach wie vor deutlich hinter der ihrer natürlichen Äquivalente zurück. Die Optimierung künstlicher Ribonucleasen und grundlegend dafür die Erforschung der Faktoren, die die Spaltaktivität einer Verbindung beeinflussen, sind daher weiterhin von großem Interesse. Zwar enthalten die meisten künstlichen Ribonucleasen Metallionen, doch sind auch metallfreie RNA-Spalter, zum Beispiel auf der Basis heterocyclischer Guanidine, bekannt. Prinzipiell kann die Hydrolyse des RNA-Rückgrates durch Deprotonierung der nucleophil am Phosphoratom angreifenden 2‘-OH-Gruppe, durch Protonierung der als Abgangsgruppe fungierenden 5‘-OH-Gruppe sowie durch Stabilisierung des bei der Spaltung durchlaufenen dianionischen Phosphorans katalysiert werden. Daher sollten potenzielle RNA-Spalter in der Lage sein, sowohl als Base als auch als Säure wirken zu können, was bei einem pKa-Wert im Bereich von 7 am besten gegeben ist. Fungiert ein und dasselbe Molekül als Protonenakzeptor und -donor, so kommt es im Fall von Guanidinanaloga zu einer Tautomerisierung vom Amino- zum Iminoisomer. Eine möglichst kleine Energiedifferenz zwischen beiden Formen sollte sich daher positiv auf die Spaltaktivität auswirken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe heterocyclischer Guanidine synthetisiert, deren pKa-Werte bestimmt und die jeweiligen Energiedifferenzen zwischen Amino- und Iminotautomer grob mittels AM1-Rechnungen abgeschätzt. In Spaltexperimenten wurden Cy5-markierte RNA-Substrate mit den verschiedenen Verbindungen inkubiert (Spalter-Konzentration: 2 bzw. 10 mM). Die Analyse und Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgten anschließend mithilfe eines DNA-Sequenziergerätes. Alle untersuchten und ausreichend löslichen Substanzen, die sowohl einen geeigneten pKa-Wert (6 – 8) als auch eine niedrige Energiedifferenz zwischen Amino- und Iminotautomer (≤ 5 kcal/mol) aufwiesen bzw. bei denen nur der pKa-Wert oder nur die Energiedifferenz in geringem Maße vom Idealwert abwich, spalteten RNA, wenn auch teilweise nur mit einer geringen Aktivität. In den Spaltexperimenten erwiesen sich Guanidinanaloga mit einem großen aromatischen System als besonders aktiv, allen voran 2-Aminoperimidin und seine Derivate, die auch bei Konzentrationen unter 50 µM Spaltaktivität zeigten. Gleichzeitig offenbarten diese Verbindungen in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Experimenten eine große Tendenz zur Aggregation mit RNA, so dass die Spaltung in diesen Fällen möglicherweise nicht durch Einzelmoleküle, sondern durch Aggregate erfolgte. Um RNA-Substrate auch sequenzspezifisch spalten zu können, wurden PNA-Konjugate des bereits bekannten RNA-Spalters Tris(2-aminobenzimidazol) hergestellt, wobei der Spalter über eine neue, quecksilberfreie Route synthetisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese PNA-Konjugate RNA sequenzspezifisch mit einer Halbwertszeit von etwa 11 h spalten, was im Rahmen der Halbwertszeit vergleichbarer DNA-Konjugate liegt. Um zu untersuchen, ob 2-Aminoperimidine auch als Einzelverbindungen aktiv sind, wurden zwei PNA-Konjugate von am Naphthylring substituierten 2-Aminoperimidin-Derivaten synthetisiert. Beide Konjugate zeigten keinerlei Spaltaktivität, was darauf hindeuten könnte, dass die Hydrolyse des RNA-Rückgrates nur durch mehrere Spalter-Einheiten – kovalent verknüpft oder in Form von Aggregaten – effizient katalysiert werden kann.
  • Artificial ribonucleases that catalyze the cleavage of the RNA backbone site-specifically and efficiently could be used not only as biochemical tools but also as drugs against various diseases involving mRNA or miRNA. Although many sequence-specific RNA cleavers have been developed in the last two decades, the cleavage activity of their natural equivalents still remains much higher. Therefore, the optimization of artificial ribonucleases and the research on factors that affect the capability to cleave RNA are still highly relevant. Though most artificial ribonucleases contain metal ions, metal-free RNA cleavers have been described as well, for example based on heterocyclic guanidines. In principle, the hydrolysis of the RNA backbone can be catalyzed in three different ways: By deprotonation of the 2’-OH-group attacking the phosphorus atom as a nucleophile, by protonation of the 5’-OH-group acting as a leaving group or by stabilization of the transitionally formed dianionic phosphorane. Thus, potential RNA cleavers should be able to serve as both acid and base catalyst. This is possible if the pKa value is in the range of 7. If one molecule acts as a base and as an acid simultaneously, it will – in the case of guanidine analogues – tautomerize from the amino into the imino isomer. Hence, an energy difference as low as possible should promote the cleavage activity. In this work, several heterocyclic guanidines were synthesized, their pKa values determined and the energy differences between amino and imino tautomer calculated roughly by AM1 method. To evaluate the degree of cleavage, Cy5-labeled RNA substrates were incubated with different compounds (cleaver concentrations: 2 or 10 mM). Analysis and quantification of cleavage products were achieved using a DNA sequencer. All sufficiently soluble compounds exhibiting both an appropriate pKa value (6 – 8) and a low energy difference (≤ 5 kcal/mol), as well as substances for which only the pKa value or the energy difference is varying slightly from the ideal, were able to cleave RNA. However, some of them cleaved only a low percentage. Cleavage experiments showed that compounds with an expanded aromatic system are particularly active, especially 2-aminoperimidine and its derivatives, for which cleavage activity could be demonstrated even at concentrations below 50 µM. At the same time, these compounds exhibited a high tendency towards aggregation detected in fluorescence correlation spectroscopy experiments. Therefore, in these cases the hydrolysis of the RNA backbone might have been catalyzed by aggregates instead of individual molecules. In order to cleave RNA substrates in a site-specific way, the known metal-free RNA cleaver tris(2-aminobenzimidazole) was conjugated to PNA oligomers. For the synthesis of the cleaver, a new and mercury-free route was established. It was shown that the PNA conjugates cleave RNA sequence-specific with a half-life of about 11 h. This is in the range of the half-life of similar DNA conjugates. To investigate whether 2-aminoperimidines are active as single molecules as well, two PNA conjugates of 2-aminoperimidine derivatives substituted at the naphthyl ring were synthesized. Both conjugates showed no cleavage activity at all, which might indicate that for an efficient hydrolysis of the RNA backbone, more than one cleaver unit is needed – either covalently bound or in a loose aggregate.

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Metadaten
Author:Friederike DannebergGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-378365
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Michael W. Göbel, Joachim W. Engels
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2015/07/14
Year of first Publication:2015
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2015/07/08
Release Date:2015/07/15
Page Number:222
HeBIS-PPN:362053995
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht