Open Access

Jonna Hakulinen

• The universal biological energy currency adenosine triphosphate (ATP) is synthesized by the F1Fo-ATP synthase in most living organisms. The overall structure and function of F-type ATPases is conserved in the different organisms. The F1Fo-ATP synthase consist of two domains; the soluble F1 complex has the subunit stoichiometry α3β3γδε and the membrane embedded Fo complex consists of subunits ab2c10-15 in its simplest form found in bacteria. F1 and Fo both function as reversible rotary motors that are connected by a central stalk (γε) and a peripheral stalk (b2δ). For ATP synthesis, the electrochemical energy formed by a proton or sodium ion gradient is required. The ion translocation across the Fo subcomplex induces torque in the motor part of the enzyme (cnγε), which causes conformational changes in the α3β3 domain leading to ATP synthesis from ADP and inorganic phosphate (Pi) catalyzed in the β-subunits. ATP hydrolysis causes a reverse torque in the Fo subcomplex triggering uphill ion translocation from cytoplasm to periplasm, and the enzyme functions as an ion pump. The ATP synthesis mechanism is well understood, since several high-resolution structures of F1 are available. In contrast, the ion translocation mechanism across the membrane, mediated by the Fo subcomplex, is not understood in its structural detail. Subunit a and the c-ring form an ion pathway, but subunit b is needed to form an active ion translocation pathway in both H+- and Na+-dependent systems. Several high-resolution structures of c-rings have provided insights in the ion translocation mechanism. The different ion translocation models based on biochemical, biophysical and structural analysis are in agreement in the fact that ions are translocated through a periplasmic ion access pathway in subunit a to the middle of the membrane and there to the binding site of a c-subunit. After almost a whole rotation of the c-ring the ion returns into the a-c interface, where it can be released to the cytoplasm. In the different models the cytoplasmic access pathway has been proposed to be located in subunit a, at the a-c interface or within the c-ring. The driving force of torque generation has been proposed to be the pH gradient or membrane potential. Several biochemical studies show that a conserved arginine in helix four of subunit a (R226 in Ilyobacter tartaricus or R210 in Escherichia coli)plays a critical role in the ion translocation. The arginine has been proposed to function as an electrostatic separator between the cytoplasmic and periplasmic pathways and as a mediator of the ion exchange into the c-ring ion-binding site. Structural data of a related enzyme (V1Vo-ATPase from Thermus thermophilus) has provided insight into the helical arrangement of the ion translocating subunits I and Lring (related to subunit a and the c-ring). These structures indicated a small interface between subunit I and the L-ring, and two four-helix bundles in the N-terminal domain of subunit I were proposed to build the periplasmic and cytoplasmic ion pathways. To comprehend the ion-translocation and torque generation mechanism in F1Fo-ATP synthase, structural data of an intact a-c complex is needed. The goal of this work was to obtain structural data of subunit a, most preferably in a complex with the c-ring or additionally with subunit b. Therefore, a new purification procedure for the I. tartaricus Fo-subcomplex, heterologously expressed in E. coli cells, was established. The purified Fo was characterized biochemically and by Laserinduced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID-MS). These analyses showed that pure and completely assembled Fo containing all its subunits in the correct stoichiometry (ab2c11) was obtained. The purified Fo complex was stable at 4°C for several months and at room temperature in the presence of lipids for several weeks. A lipid analysis was performed by thin-layer chromatography (TLC) to investigate the qualitative lipid composition of I. tartaricus whole lipid extract and various I. tartaricus F1Fo isolates. The whole lipid extract contained PC, PG and PE lipids and probably cardiolipin. PC, PG and PE lipids were bound to wild type I. tartaricus F1Fo, whereas recombinant I. tartaricus F1Fo did not have any bound lipids, but was able to bind the synthetic lipids POPC and POPG if they were provided during the purification. For subsequent structural studies the purified Fo was subjected to two-dimensional (2D) crystallization trials. Vesicles and sheets tightly packed with protein and crystals with a rare plane group for I. tartaricus c11 (p121) were obtained. The c-ring was visible in the CCD images, and immunogold-labeling revealed the presence of the His-tagged a-subunit in the reconstituted vesicles. Furthermore, atomic force microscopy (AFM) imaging showed protein densities next to the c-rings, which protruded less from the membrane (0.4±0.1 nm) than the c-ring (0.7±0.1 nm). These protein densities presumably belonged to subunit a. Cryo-electronmicroscopy (cryo-EM) was used to collect data of the p121 crystals and a merged projection density map was calculated to 7.0 Å resolution. The unit cell of the crystals (81 × 252 Å) contained two asymmetric units with three c-rings in each and next to the c11-rings new prominent densities were visible. In each extra density up to 7 transmembrane helices were visible, belonging to the stator subunit a and/or subunit b. To elucidate whether there are conserved elements in the three extra densities non-crystallographic averaging was applied using a single-particle approach. Six possible arrangements for the c-rings and the extra densities were identified and used for the averaging. The extra densities were enhanced only in one of the possible arrangements. The average showed a four-helix bundle and a fifth helix in close proximity to the c-ring. Two more helices were present in each position but their position was ambivalent. The data obtained in this work provides the first insight in the helical arrangement in the a-c interface of F1Fo-ATP synthase.
• Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle Energieträger in allen Organismen. Die Hydrolyse von einer Phosphoanhydridbindung gibt der Zelle ~30 kJ/mol Energie frei, die für verschiedene metabolische Prozesse verwendet werden kann. Die Energie für die ATP Synthese wird durch drei Hauptstoffwechsel für die Zelle freigesetzt: die oxidative Phosphorylierung, Substratkettenphosphorylierung und Photophosphorylierung. Zudem gibt es Organismen, die den Energiegewinn durch die Decarboxylierungsphosphorylierung erzielen. All diese Stoffwechselwege erzeugen einen Gradienten von Protonen bzw. Natriumionen, die zur ATP Synthese verwendet wird. ATP kann in der Zelle nicht gespeichert werden, daher muss es kontinuierlich produziert werden. Schätzungsweise verbraucht der Mensch fast sein eigenes Körpergewicht an ATP pro Tag. Der größte Teil von ATP wird von F1Fo-ATP Synthase, bzw. von A1Ao-ATP Synthase in Archea, synthetisiert. Die Struktur und Funktion der F1Fo-ATP Synthase ist in verschiedenen Organismen konserviert. In Bakterien liegt die F1Fo-ATP Synthase in der Plasmamembran, in phototrophischen Bakterien und in Chloroplasten in der Thylakoidmembran und in Mitochondrien in der inneren Membran. F1Fo-ATP Synthase besteht aus zwei individuellen Teilen: der lösliche F1-Teil besteht aus Untereinheiten α3β3γδε und der Membranteil Fo ist zusammengesetzt aus Untereinheiten ab2c10-15 in Bakterien. Die ATP-Synthese selbst findet in F1 statt. Der Fo-Komplex transloziert Ionen über die Membran und setzt dadurch elektrochemische Energie für die ATP Synthese zur Verfügung. F1 und Fo sind zentral mit Untereinheiten γ and ε und peripheral mit Untereinheiten b2 und δ verbunden. F1 und Fo sind beides reversible Drehmotoren, die beide zu eigenständig funktionierenden Einheiten getrennt werden können. Die ATP Synthese und ATP Hydrolyse kann nur erfolgen, wenn F1 and Fo miteinander in der Weise verbunden sind, dass die Energieübertragung zwischen den beiden Einheiten ermöglicht ist (Kopplung). F1Fo hat eine Motoreinheit (cnγε), die während der Katalyse rotiert, wobei das Rest des Enzyms als Stator (α3β3δab2) fungiert. Die Rotation der Motoreinheit verursacht Konformationsveränderungen in der α3β3 Domäne, die zur ATP Synthese aus ADP und Pi in den katalytischen Zentren der β-Untereinheiten führt. Die ATP Hydrolyse verursacht ein entgegengesetztes Drehmoment im Fo Komplex und bewirkt Ionentranslokation vom Zytoplasma zum Periplasma, wobei das Enzym als Ionenpumpe fungiert. Der ATP Synthesemechanismus ist durch mehrere hochauflösende F1 Strukturen sehr gut aufgeklärt. Im Gegensatz dazu ist der exakte Ionentranslokationsmechanismus im Fo-Teil noch weniger detailliert beschrieben. Die Untereinheit a und der c-Ring bilden physisch den Ionentranslokationsweg, aber auch die Untereinheit b wird benötigt um die Funktionalität des Fo-Komplexes zu ermöglichen. In den letzten Jahren konnten mehrere c-Ring Strukturen wichtige Informationen über den Mechanismus von Fo liefern. Biochemische, biophysikalische und strukturelle Untersuchungen belegen, dass Ionen durch die Untereinheit a vom Periplasma zur Mitte der Lipiddoppelschicht transloziert werden. Dort kann das Ion an die Bindungsstelle der c-Untereinheit binden. Nach einer fast kompletten c-Ring Rotation kehrt das Ion zurück an die Interaktionsfläche der Untereinheit a und dem c-Ring und kann auf diese Weise ins Zytoplasma abgegeben werden. Verschiedenen Modelle schlagen vor, dass der zytoplasmatische Ionentranslokationsweg sich entweder in der Untereinheit a, an der Interaktionsfläche von a und c-Ring bzw. vielleicht auch im c-Ring selbst befindet. Der pH Gradient und das Membranpotential sind als Antriebskraft für die H+- bzw. Na+- Translokation verantwortlich. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ein konserviertes Arginin in Helix 4 der a-Untereinheit (R226 in Ilyobacter tartaricus oder R210 in Escherichia coli) eine entscheidende Rolle in der Funktion des Fo- Komplexes spielt. Dieses Arginin soll als elektrischer Separator zwischen den zytoplasmatischen und periplasmatischen Ionentranslokationswegen fungieren und auch den Ionenaustausch an der Bindestelle des c-Rings vermitteln. Kryo-EM Einzelpartikel Strukturen von einer nahe verwandte rotations V1Vo-ATPase aus Thermus thermophilus konnten einen ersten Einblick in die Anordnung der Helizes der Untereinheiten I und des L-Rings (äquivalente Proteine zur Untereinheit a und c- Ring) liefern. Diese Strukturen zeigten eine sehr kleine Interaktionsfläche zwischen Untereinheit I und L-Ring. Weiterhin waren zwei vier-Helix Bündel im N-Terminus der Untereinheit I sichtbar, die als periplasmatischer und zytoplasmatischer Ionentranslokationsweg vorgeschlagen wurden. Solche Strukturinformationen waren für die F1Fo-ATP Synthase nicht verfügbar. Um den Ionentranslokationsmechanismus im bakteriellen Fo Komplex besser zu verstehen, wurden deshalb strukturelle Daten des a-c Komplexes benötigt. Daher war es das Ziel dieser Arbeit strukturelle Daten der Untereinheit a, vorzugsweise im Komplex mit dem c-Ring und wenn möglich auch mit der Untereinheit b zu erhalten. In dieser Arbeit wurde ein Konstrukt für die Protein Expression verwendet, in dem Gene vom I. tartaricus ATP Synthase Operon mit einem N-terminalen His12-Tag in der Untereinheit a in den Expressionsvektor pTrc99A kloniert waren. Die I. tartaricus F1Fo-ATP Synthase wurde heterolog in E. coli Zellen synthetisiert. Die Proteinausbeute lag bei weniger als 1 mg Protein / Kulturliter und häufig wies die gereinigte F1Fo Kontaminationen bei der SDS-PAGE Analyse auf. Daher wurden verschiedene Medien, Medienvolumen, Expressionstemperaturen, und -längen, Induktionszeitpunkte, Mengen an IPTG, Autoinduktion und Expression im Fermenter getestet. Je höher die Proteinausbeute war, desto niedriger war die spezifische Aktivität des gereinigten Proteins und mehr Kontaminationen wurden bei der SDS-PAGE Analyse entdeckt. Das Kulturvolumen bzw. der Sauerstoffgehalt während der Expression erwiesen sich nicht als entscheidende Faktoren um reine, aktive F1Fo zu erhalten. Das ZY505-Medium mit IPTG Induktion (0.2 mM) bei 37°C für zwei Stunden zeigte sich als beste Expressionsbedingung. 0.2-0.8 mg reines F1Fo / Kulturliter konnten isoliert werden, wobei die Spezifische Aktivität des Proteins bei 8.8 U/mg lag. Zur Reinigung des Fo-Komplexes I. tartaricus F1Fo wurde in E. coli heterolog synthetisiert und nach dem Zellaufbruch und der Isolation der Membranfraktion wurden verschiedene Verfahren zur Trennung von F1 und Fo getestet. Die Membranen wurden im Puffer mit EDTA bzw. mit chaotropen Substanzen (Harnstoff bzw. Guanidinium-HCl) gewaschen. Anschließend wurde das Protein solubilisiert und auf Ni2+-NTA gereinigt. Als beste Methode für die Trennung von F1 von Fo erwies sich die Inkubation der Membranen mit 3.5 M Harnstoff für 30 Minuten bei 4°C. Dabei wurde F1 vollständig von Fo getrennt und Fo mit allen Untereinheiten (a, b2, c-Ring) konnte erhalten werden. Der gereinigte Fo-Komplex wurde weiterhin biochemisch analysiert. Die a-Untereinheit mit dem His12-tag zeigte keine Degradation in der Western blot-Analyse. Die Assemblierung von Fo wurde mittels zweidimensionale Gelelektrophorese sowie Größenaufschluss-Chromatographie untersucht. Die zweidimensionale Gelelektrophorese zeigte, dass alle Fo Untereinheiten (a, b und c-Ring) auf der gleichen Höhe wanderten, und daher komplett assembliert waren. In der Größenaufschluss-Chromatographie Fo zeigte sich als ein einzelner „Peak“, was darauf hin deutete, dass der Komplex vollständig assembliert war. Gereinigte Wildtyp I. tartaricus F1Fo, heterolog in E. coli exprimierte I. tartaricus F1Fo und isolierter Fo wurden mittels LILBID-Massenspektrometrie untersucht. Beide F1Fo-Komplexe zeigten bei niedriger Laserintensität ein Komplex bei 548±5 kDa, was der theoretisch berechneten Masse des F1Fo-Komplexes entspricht. Mit hoher Laserintensität wurden beide Komplexe in einzelne Untereinheiten getrennt, wobei alle F1Fo-Untereinheiten bei den theoretisch berechneten Massen entdeckt wurden. Der Fo-Komplex wurde mit niedriger Laserintensität bei 168±2 kDa ermittelt, was der theoretisch berechneten Masse des Komplexes entsprach. Mit hoher Laserintensität wurden Untereinheiten a, b1 und c1 sowie höhere Oligomerzustände der c- Untereinheit entdeckt. Die biochemischen Untersuchungen und auch die Resultate der LILBID-MS ergaben, dass der gereinigte Fo-Komplex assembliert war und alle Untereinheiten ohne Kontaminationen erhielte. Weiterhin wurde eine Lipidanalyse anhand der Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um Lipide, die gegebenenfalls für Stabilität und Funktion von F1Fo wichtig sind, zu ermitteln. Für die Analyse wurde zunächst I. tartaricus Lipidextrakt, aber auch die gereinigte Wildtyp I. tartaricus F1Fo und die heterolog in E. coli synthetisierte I. tartaricus F1Fo verwendet. I. tartaricus Lipidextrakt bestand aus PC, PG und PE Lipiden und möglicherweise aus Cardiolipin. I. tartaricus F1Fo hatte PC, PG und PE Lipide gebunden, wogegen rekombinante F1Fo keine gebundene Lipide aufwies. Falls synthetisch hergestellte Lipide POPC, POPG und POPE während der Reinigung zur rekombinanten F1Fo gegeben wurden, waren POPC und POPG an dem Protein gebunden. Wegen der niedrigen Syntheserate von F1Fo war auch die Fo Ausbeute niedrig, nur 0.4-1.5 mg/ 2 × 6 L. Dies erschwerte die systematische Untersuchung der wichtigen Parameter für die Kristallisation des Fo-Komplexes. Für die 3D-Kristallisation war die Ausbeute zu niedrig, daher wurde der Fo-Komplex in 2D kristallisiert. Häufig wurden dabei mit Protein dichtgepackte Vesikel und „sheets“ gebildet. Das Präsenz des c- Ringes konnte in den CCD-Bildern festgehalten werden, dagegen die Anwesenheit der Stator Untereinheiten a und b2 war nicht direkt ersichtlich. Immunogoldmarkierung wurde verwendet, um die Anwesenheit der Untereinheit a mit His12-tag in den Vesikeln zu untersuchen. Dabei konnte eindeutig gezeigt werden, dass die Untereinheit a sich zusammen mit dem c-Ring in Vesikeln befindet. Zusätzlich wurden die Fo-Proben mittels der Rasterkraftmikroskopie („atomic force microscopy“) untersucht. Neben den c-Ringen konnten deutliche Proteindichten erkannt werden, die niedriger aus der Membran herausragten (0.4±0.1 nm) wie der c- Ring (0.7±0.1 nm). Diese Proteindichten stellen vermutlich die Untereinheit a dar. Bei manchen Kristallisationsansätzen wurden Kristalle mit für I. tartaricus c11-Ring seltene Ebengruppe p121 enthalten. Diese Kristalle formten sich in der POPC:POPG:POPE-Mischung in Lipid-zu-Protein Verhältnissen von 0.94-1.25 bei 20-25°C im Puffer mit pH 8.0 und 150-250 mM KCl. Anhand Kryo-EM wurden ~900 Bilder von diesen Proben gesammelt. In 9 Bildern wurden Kristallbeugung mit der p121 Symmetrie entdeckt und Daten von 5 Kristallen wurden als eine Projektionsdichtekarte bis 7.0 Å zusammengefasst. Die Einheitszelle (81 × 252 Å) besaß zwei asymmetrischen Einheiten mit drei c-Ringen jeweils und in der Nähe des jeweiligen Rings war eine neue Elektronendichte erkennbar. In der jeweiligen neuen Dichte waren bis zu 7 Transmembranhelizes erkennbar, die zur Untereinheit a bzw. zu Untereinheiten a und b gehörten. Um zu untersuchen, ob in den neuen Dichten konservierte Elemente vorliegen, eine Kreuzkorrelationsanalyse („noncrystallographic symmetry averaging“) basierend auf die Durchschnittsberechnung anhand der Einzelteilchen Analyse wurde durchgeführt. Sechs verschiedene Anordnungen der c-Ringe mit den neuen Dichten wurden identifiziert und für die Kreuzkorrelationsanalyse verwendet. Die neuen Dichten wurden nur bei einer der möglichen Anordnungen verstärkt. Die neuen Dichten wiesen ein vier-Helix Bündel auf, neben dem eine fünfte Helix in der Nähe des c-Rings vorlag. Zwei weitere Helizes waren sichtbar in der jeweiligen Stelle, aber in unterschiedlichen Positionen. Damit liefert diese Arbeit die ersten strukturellen Daten über die Helix Anordnung in der a-c Interaktionsfläche in der bakteriellen F1Fo-ATP Synthase.