Open Access

Frederike Margarete Lam

• The role of lncRNAs in the CVS and the endothelium is highly diverse and has been subject to a substantial amount of research over the last decade. The identification of lncRNAs as clinically relevant biomarkers and as co-regulatory molecules let to the appreciation of the functional relevance of lncRNAs. In the present study, LINC00607 was identified as an endothelial-enriched, human-specific lncRNA. With its distinct functions, LINC00607 maintains and supports the endothelial homeostasis especially in response to VEGF-A signalling. In the first part of this study, LINC00607 was functionally characterized in human endothelial cells. LINC00607 is highly and specifically expressed in endothelial cells and is differentially regulated in CVDs. Depletion of LINC00607 resulted in decreased angiogenic sprouting, reduced integration of ECs in a newly formed vascular network in vivo, enhanced endothelial migration and differential expression of many important genes for endothelial cell homeostasis. Functionally, LINC00607 maintains ERG-driven endothelial gene expression programs through BRG1. BRG1 secures stably accessible enhancer regions as well as TSS of ERG target genes, thus enabling transcription of endothelial gene programs. The second part of this study proposes an additional mode of action for LINC00607. The strongly impaired response to VEGF-A after LINC00607 KO can only be partially explained by its’ expression control of ERG target genes. It rather appears that LINC00607 is involved in the control of alternative splicing of VEGF receptor FLT1. The differential splicing of FLT1 produces the anti-angiogenic soluble isoform of FLT1. Even though further validation is needed to uncover the underlying mechanism, there is the potential of a more general role of LINC00607 in splicing control through BRG1. As AS of FLT1 is a clinical marker in preeclampsia, LINC00607 might qualify to be an additional marker for the onset and manifestation of the pregnancy disorder. Taken together, LINC00607 is a target in future for molecular therapy in CVD to restore a healthy endothelial phenotype and has the potential to serve as a biomarker in preeclampsia.
• Lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) sind definiert als Transkripte mit einer Länge von mehr als 200 Nukleotiden, die nicht in Proteine übersetzt werden. Als biologisch aktive Moleküle interagieren lncRNAs mit Proteinen, DNA und RNA und spielen eine Rolle in der Genomorganisation, Genexpression und Zellstruktur. Im Zellkern beeinflussen lncRNAs die Transkription, indem sie die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TFs) an das Chromatin modulieren, oder die Rekrutierung von Komplexen zur Umgestaltung des Chromatins verändern. Chromatin-Remodelling Komplexe (CRC) verändern die Zugänglichkeit des Chromatins u.a. durch Verschieben oder Entfernen von Nukleosomen. Einer dieser CRCs ist der SWI/SNF Komplex, dessen Aktivität von der zentralen ATPase BRG1 abhängt und durch lncRNAs beeinflusst werden kann. Ein anderer wichtiger zellulärer Prozess, der von lncRNAs mitgesteuert wird ist alternatives Splicing (AS). Splicing beschreibt den Prozess der Bearbeitung von prä-mRNA zu reifer mRNA. Dabei werden Introns entfernt und kodierende Exons vereint. Diese Prozesse sind besonders wichtig in Endothelzellen. Sie bilden die innere einzellige Schicht der Blutgefäße, die als semipermeable Barriere dient, um die Gefäßwand vom zirkulierenden Blut zu trennen. Das Endothel ist entscheidend für eine angemessene Anpassung an verschiedene physiologische und pathologische Reize, wie zum Beispiel Gewebehypoxie, die Angiogenese in umliegenden Gefäßen auslöst. Fehlgeleitete Reaktionen auf diese Reize, in Form von Chromatin Umgestaltung und alternativem Splicing, können zur Entwicklung von endothelialer Dysfunktion führen, die eine Grundlage für viele Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellt. Die vielfältigen Funktionen und Expression von lncRNAs sind meist zelltypspezifisch. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der lncRNA LINC00607. Diese lncRNA weist eine starke endothelzellspezifische Expression auf und reguliert die Aktivität des Chromatin-Remodellers BRG1 sowie AS des VEGF Rezeptors FLT1. LINC00607 spielt eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des endothelspezifischen Geno- und Phänotypen. LINC00607 wurde als eine lange nicht-kodierende intergene RNA identifiziert, die eine hohe Expression in Endothelzellen hat und in fast keinem anderen Zelltyp exprimiert wird. LINC00607 weist auch eine veränderte Expression in Herz-Kreislauf-Erkrankungen auf: in postatherosklerotischen Endothelzellen und in Propranolol behandelten Atheriovenösen Missbildungen war die LINC00607 Expression weiter gesteigert. Eine Promoteranalyse identifizierte DNA-Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren HIF1A, ARNT und SMADs. Die Expressionsregulation durch diese TFs konnte durch Inkubation von HUVEC (humane Nabelschnurvenen-Endothelzellen) in Hypoxie und mit der Induktion von EndMT (Endothelial-Mesenchymale Transition) validiert werden. In beiden Fällen kam es zu einer erhöhten LINC00607 Expression. Um die Rolle von LINC00607 in Endothelzellen besser zu verstehen, wurden Knockdown- und Deletionsversuche mittels siRNA und CRISPR/Cas9 durchgeführt. Physiologische Assays wurden verwendet, um die Auswirkungen auf die Funktion der Zellen zu bewerten. Die Deletion von LINC00607 führte zu einer geringeren Integration von Endothelzellen in ein neu-gebildetes vaskuläres Netzwerk in vivo und einer verstärkten Migration der Endothelzellen. Zudem kam es zu einer verminderten angiogenen Sprossung nach VEGF Stimulation in einem Spheroid-Auswuchs Assay, die jedoch durch die Überexpression von LINC00607 wiederhergestellt werden konnte. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) wurde durchgeführt, um die molekularen Veränderungen der Genexpression in LINC00607 KO- und Kontrollzellen zu untersuchen. Dabei wurde festgestellt, dass die Expression mehrerer endothelialer Genprogramme stark abnahm, einschließlich der Signalwege des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), der extrazellulären Matrixorganisation und der Zelladhäsionsmoleküle wie ITGA10 und PECAM1. Auf der anderen Seite wurden Gene, die mit DNA-Replikation und dem Zellzyklus in Verbindung stehen, verstärkt exprimiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Endothelzellen ohne LINC00607 ihren Endothelzellcharakter verlieren und scheinbar den sonst starren Zellverband verlassen, um zu migrieren und zu proliferieren. Diese vielfältigen Veränderungen der Genexpressionen können nur partiell durch die Deletion von LINC00607 erklärt werden, weshalb eine ATAC Sequenzierung (ATAC-Seq) durchgeführt wurde. Auf diese Weise können Veränderungen der Zugänglichkeit des Chromatins festgestellt werden. Die ATAC-Seq wurde einer DNA Motif Anreicherungsanalyse unterzogen, die differentiell zugängliche TF-Erkennungsmotife der DNA nach LINC00607 KO identifizierte. Unter den Motifen, mit dem stärksten Rückgang der Zugänglichkeit befand sich das Erkennungsmotif für den TF ERG (ETS Transkriptions Faktor). Dieser TF ist Teil der Gruppe der ETS TFs, die eine der wichtigsten TF Gruppen in Endothelzellen ist. Sie kontrolliert die Differenzierung der Endothelvorläuferzellen zu Endothelzellen und vor allem ERG reguliert die Expression aller wichtigen Gene, die in der endothelialen Homöostase benötigt werden. Dies ist bekannt, da das ERG-DNA-Bindemotif in jedem Promoter der endothelspezifischen Gene zu finden ist. Die verminderte Zugänglichkeit des ERG-Bindemotifs in Endothelzellen nach LINC00607 KO könnte die vielfältigen Veränderungen der Genexpression erklären.