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Guangwei Xing

• Gravitropism is a fundamental process in plants that allows shoots to grow upward and roots to grow downward. Protein phosphorylation has been postulated to participate in the intricate signaling cascade of gravitropism. In order to elucidate the underlying mechanisms governing the gravitropic signaling and unearth novel protein constituents, an exhaustive investigation employing microgravity-induced phosphoproteomics was undertaken. The significantly phosphorylated proteins unraveled in this study can be effectively divided into two groups through clustering analysis. Furthermore, the elucidation of Gene Ontology (GO) enrichment analysis disclosed the conspicuous overrepresentation of these clustered phosphoproteins in cytoskeletal organization and in hormone-mediated responses intimately intertwined with the intricate phenomenon of gravitropism. Motif enrichment analysis unveiled the overrepresentation of [-pS-P-] and [-R-x-x-pS-] motifs. Notably, the [-pS-P-] motif has been suggested as the substrate for the Casein kinase II (CK II) and Cyclin-dependent kinase (CDK). Kinase-inhibitor assays confirmed the pivotal role played by CK II and CDK in root gravitropism. Mutant gravitropism assays validated the functional significance of identified phosphoproteins, with some mutants exhibiting altered bending kinetics using a custom-developed platform. The study also compared phosphoproteomics data from different platforms, revealing variations in the detected phosphopeptides and highlighting the impact of treatment differences. Furthermore, the involvement of TOR signaling in microgravity-induced phosphorylation changes was uncovered, expanding the understanding of plant gravitropism responses. To fulfill the large-scale verification of interesting candidates from the phosphoproteomics study, a novel root and hypocotyl gravitropism phenotyping platform was developed. This platform integrated cost-effective hardware, including Raspberry Pi, a high-quality camera, an Arduino board, a rotation stage (obtained from Prof. Dr. Maik Böhmer), and programmable green light (modified by Sven Plath). In addition, through collaboration with a software developer, machine-learning-based software was developed for data analysis. This platform tested the gravitropic response of candidate mutants identified in the phosphoproteomics study. Furthermore, the capabilities of this platform were expanded to investigate tropisms in other species and organs. To find novel proteins that might act as partners of a key protein that is involved in gravitropism signaling, ALTERED RESPONSE TO GRAVITY 1 (ARG1), immunoprecipitation coupled with Mass Spectrometry (IP-MS) was performed and identified ARG1-LIKE1 (ARL1) as a potential interacting protein with ARG1. This interaction was further confirmed through in vivo pull-down assays and bimolecular fluorescence complementation assays. In addition, the interaction between ARG1 and HSP70-1 was also validated. Overall, this thesis sheds light on the molecular components and signaling events involved in plant gravitropism. It contributes to existing knowledge and opens up new ways to investigate this fascinating area of plant biology.
• Der Gravitropismus ist ein grundlegender Prozess in Pflanzen, der es Sprossen ermöglicht, nach oben zu wachsen, und Wurzeln, nach unten zu wachsen. Die Phosphorylierung spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung des pflanzlichen Gravitropismus, da sie als entscheidender Mechanismus für die Übertragung und Modulation von Signalen dient, die an diesem grundlegenden biologischen Prozess beteiligt sind (Schepetilnikov et al., 2013; Van Leene et al., 2019). Mehrere Kinasen, darunter PID (Grones et al., 2018), D6PK (Tan et al., 2020), und TOR (Schepetilnikov et al., 2013) wurden als potenzielle Schlüsselfaktoren für die Vermittlung der gravitropischen Reaktion in Pflanzen identifiziert. Darüber hinaus wird die Gravitropismus-Reaktion schnell eingeleitet und tritt in der Regel innerhalb von Sekunden nach der gravitropischen Stimulation auf (Zheng et al., 2015). Um tiefere Einblicke in die molekularen Vorgänge zu gewinnen, die in den ersten Sekunden der Schwerelosigkeit auftreten, wurde in dieser Studie eine Phosphoproteomik-Studie an Arabidopsis-Keimlingen durchgeführt. Durch die Konzentration auf diese frühe Zeitspanne sollten die dynamischen Phosphorylierungsereignisse erfasst werden, die eine entscheidende Rolle bei der Reaktion der Pflanze auf die veränderten Schwerkraftbedingungen spielen. Für diese Studie wurden zwei bewährte Plattformen verwendet: der Fallturm und die Parabelflugplattform, die vom Zentrum für angewandte Raumfahrttechnologie und Mikrogravitation (ZARM) in Bremen und von Novespace in Bordeaux, Frankreich, zur Verfügung gestellt wurden. Die umfassende Analyse in dieser Studie ergab insgesamt 4.266 Phosphosites. Die in dieser Studie beobachteten Phosphorylierungsmuster und Rückstandsverhältnisse stimmten mit früheren Arabidopsis-Phosphoproteomik-Studien überein, was die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bestätigte (Yang et al., 2020; Andrea Vega et al., 2021; Rayapuram et al., 2021). Die Analyse der signifikant unterschiedlich phosphorylierten Peptide in der Hypergravitationsbehandlung sowie in den 3 s und 22 s Mikrogravitationsbehandlungen ergab interessante Überschneidungsmuster. Insgesamt 85 Peptide wurden in allen drei Versuchsgruppen gemeinsam gefunden, was auf eine gemeinsame Reaktion unter diesen Bedingungen hindeutet. Abgesehen von den 85 Peptiden, die alle drei Gruppen gemeinsam hatten, wurden 53 Peptide sowohl in der Hypergravitations- als auch in der 3-Sekunden-Mikrogravitationsbehandlung gefunden, während weitere 53 Peptide sowohl in der Hypergravitations- als auch in der 22-Sekunden-Mikrogravitationsbehandlung zu finden waren. Darüber hinaus wurden 130 Peptide zwischen der 3-Sekunden- und der 22-Sekunden-Behandlung unter Mikrogravitation gefunden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bestimmte Proteine konsistente Veränderungen in ihren Phosphorylierungszuständen über die verschiedenen Dauern der Mikrogravitations- und Hypergravitationsexposition aufweisen, was auf eine gemeinsame Reaktion und potenzielle Regulierungsmechanismen als Reaktion auf die Schwerkraftänderungen hindeutet. Zu den angereicherten Gene Ontology (GO)-Begriffen für die signifikant unterschiedlich phosphorylierten Proteine in der 3-Sekunden-Mikrogravitationsbehandlung gehörten "Signaltransduktion", "Mikrotubuli-Zytoskelett-Organisation" und "Protein-Targeting zur Vakuole, beteiligt am Ubiquitin-abhängigen Proteinkatabolismus über den multivesikulären Körpersortierweg". Diese Ergebnisse unterstreichen die rasche Aktivierung von Signalwegen und die Beteiligung von Zytoskelett- und Lipid-Signalproteinen in den frühen Stadien der Gravitropismus-Reaktion. Im Gegensatz dazu zeigte die 22-s-Mikrogravitationsbehandlung eine Anreicherung nur in Bezug auf biologische Prozesse, insbesondere bei der zellulären Reaktion auf Hormonreize und Salicylsäure-vermittelte Signalwege. Dies deutet darauf hin, dass eine längere Mikrogravitations-Exposition spezifische biologische Prozesse im Zusammenhang mit Hormonreaktionen und Signalübertragung auslösen kann.