Open Access

Anja Roden

• This work provides new insights into the relevance of SBP dependent secondary transport systems, especially in the thus far under-researched subgroup of TAXI transporters. Importantly, we identified and characterized the TAXI transport system TAXIPm-PQM from Proteus mirabilis. We demonstrated that, in contrast to previously characterized SBP dependent secondary transport systems, TAXIPm-PQM is a proton coupled system and transports the C5-dicarboxylate α- ketoglutarate. Since initially the transport of α-ketoglutarate could only be demonstrated in vivo but not in vitro using established protocols (Mulligan et al. 2009), we investigated in detail the differences between the in vivo and in vitro assay. This resulted in a bioinformatic analysis of TRAP and TAXI signal peptides, which strongly implied that TAXIPm-P requires a transmembrane anchor to allow for transport. We then provided TAXIPm-P surface tethered to the membrane in in vitro transport assays and confirmed the prediction of our bioinformatic analysis that TAXIPm-PQM deploys a membrane-anchored instead of a soluble SBP. Furthermore, the TAXI transport system TAXIMh-PQM from Marinobacter hydrocarbonoclasticus transports fumarate only if both membrane domains Q and M are present. For further characterization, Michaelis-Menten kinetics and affinities were determined for both TAXI transport systems TAXIPm-PQM from Proteus mirabilis and TAXIMh-PQM from Marinobacter hydrocarbonoclasticus. In addition, nanobodies were selected for the membrane domain TAXIPm-QM from Proteus mirabilis to stabilize different conformations which can serve in subsequent structural elucidation studies. Furthermore, the TRAP SBP TRAPHi-SiaP from Haemophilus influenzae was shown to interact not only with its corresponding membrane domain TRAPHi-SiaQM but with at least one additional transporter. It was thereby excluded that TRAPHi- SiaP transfers N-acetylneuraminic acid to the only native E. coli TRAP transporter TRAPEc-YiaMNO and suggested to rather interact with a SBP dependent ABC transport system as this protein family represents the largest SBP dependent protein group in E. coli (Moussatova et al. 2008).
• Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die Bedeutung von SBP-abhängigen sekundären Transportsystemen, insbesondere in die bisher wenig erforschten Untergruppe der TAXI-Transporter. Wichtig ist, dass wir das TAXI-Transportsystem TAXIPm-PQM aus Proteus mirabilis identifiziert und charakterisiert haben. Wir konnten zeigen, dass TAXIPm-PQM im Gegensatz zu bisher charakterisierten SBP-abhängigen sekundären Transportsystemen ein protonengekoppeltes System ist, das das C5-Dicarboxylat α-Ketoglutarat transportiert. Da der Transport von α-Ketoglutarat zunächst nur in vivo, nicht aber in vitro mit etablierten Protokollen nachgewiesen werden konnte (Mulligan et al. 2009), haben wir die Unterschiede zwischen dem in vivo und dem in vitro Assay im Detail untersucht. Dies führte zu einer bioinformatischen Analyse der TRAP- und TAXI- Signalpeptide, die stark darauf hindeutete, dass TAXIPm-P einen Transmembrananker benötigt, um den Transport zu ermöglichen. Wir haben dann TAXIPm-P in in vitro Transportversuchen an die Membran gebunden und die Vorhersage unserer bioinformatischen Analyse bestätigt, dass TAXIPm-PQM ein membranverankertes statt ein lösliches SBP einsetzt. Außerdem transportiert das TAXI-Transportsystem TAXIMh-PQM aus Marinobacter hydrocarbonoclasticus Fumarat nur, wenn beide Membrandomänen Q und M vorhanden sind. Zur weiteren Charakterisierung wurden Michaelis-Menten-Kinetik und Affinitäten für die beiden TAXI-Transportsysteme TAXIPm-PQM aus Proteus mirabilis und TAXIMh-PQM aus Marinobacter hydrocarbonoclasticus bestimmt. Darüber hinaus wurden für die Membrandomäne TAXIPm-QM von Proteus mirabilis Nanobodies selektiert, um möglicherweise verschiedene Konformationen zu stabilisieren, die in späteren Strukturaufklärungsstudien verwendet werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass das TRAP-SBP TRAPHi-SiaP aus Haemophilus influenzae nicht nur mit der zugehörigen Membrandomäne TRAPHi-SiaQM, sondern mit mindestens einem weiteren Transporter interagiert. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass TRAPHi-SiaP N-Acetylneuraminsäure auf den einzigen nativen E. coli TRAP-Transporter TRAPEc-YiaMNO überträgt, und es wurde vermutet, dass TRAPHi-SiaP eher mit einem SBP-abhängigen ABC-Transportsystem interagiert, da diese Proteinfamilie die größte SBP-abhängige Proteingruppe in E. coli darstellt (Moussatova et al. 2008).