Adaptormoleküle zur Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren oder miRNAs an nicht native Bindestellen
- Die Kontrolle der Genexpression ist eines der großen Ziele der chemischen Biologie. Gemäß dem klassischen Dogma der Molekularbiologe verläuft der Fluss der genetischen Information über die Transkription von DNA zur messenger RNA (mRNA) und durch die Translation von mRNA zu Proteinen. Auch wenn der ursprünglichen Formulierung dieses Dogmas verschiedene Aspekte hinzugefügt wurden, bleibt die Kernaussage unverändert. Eine Störung der Genexpression ist in vielen Fällen die Ursache für schwerwiegende Erkrankungen. Klassische Therapeutika, die im Allgemeinen aus kleinen Molekülen bestehen, können pathogene Proteine spezifisch binden und inhibieren. Allerdings greifen diese Wirkstoffe am Ende der Produktionskette ein und nicht alle Proteine können adressiert werden. Im Gegensatz dazu könnte ein Eingriff auf der Ebene der Transkription oder Translation die Expression der pathogenen Proteine auf ein normales Maß senken oder ganz verhindern. Als entscheidende Regulatoren der Genexpression stellen Transkriptionsfaktoren (TFs) einen interessanten Angriffspunkt zur Kontrolle der Transkription dar. TFs können über den Kontakt zu weiteren Proteinen die RNA Polymerase II rekrutieren und so die Transkription starten. Für die Translation ist die Halbwertszeit der mRNA ein entscheidender Faktor. Die Lebensdauer wird durch eine Vielzahl an Proteinen und micro RNAs (miRNAs) reguliert. MiRNAs sind kurze Oligonukleotide, die in Argonautproteine eingebaut werden können. Die daraus resultierenden RNA-induced silencing complexes (RISCs) sind in der Lage, den Abbau der mRNA einzuleiten. Sowohl TFs als auch RISCs besitzen dabei Nukleinsäure-bindende Untereinheiten, die mit spezifische Sequenzen assoziieren. In gewisser Weise ist die molekulare Erkennung der Nukleinsäuren vergleichbar mit einer Postsendung, die aufgrund der Adresse korrekt zugestellt wird. Um in diesem Bild des täglichen Lebens zu bleiben: Bei einem Wechsel des Wohnorts ist es üblich, einen Nachsendeauftrag zu stellen. Dabei wird die alte Anschrift auf den Postsendungen mit einem neuen Adressetikett überklebt und die Zustellung erfolgt an den neuen Wohnort. Das zentrale Thema dieser Dissertation ist, dieses „Umetikettieren“ auch auf TFs und RISCs zu übertragen. Hierbei ist es notwendig, die Nukleinsäure-bindenden Untereinheiten der Komplexe, also die „alte Adresse“, vollständig zu blockieren und gleichzeitig eine hohe Affinität zu einer neuen Sequenz zu erzeugen. Hierzu könnten bifunktionale Adaptormoleküle verwendet werden. Die Adaptoren für die Rekrutierung von TFs müssen in der Lage sein, sowohl die doppelsträngige DNA (dsDNA) als auch einen TF zu binden (Abbildung I). Dabei sollte eine Selbstbindung des Adaptors vermieden werden. In dieser Arbeit wurde der TF Sp1 als Ziel gewählt, da er an GC-reiche dsDNAs bindet. Dies ermöglicht die Wahl einer AT- oder GA reichen DNA-Sequenz als Ziel der Umleitung, wodurch eine Selbstbindung des Adaptors minimiert werden sollte. Zur Erkennung der DNA war geplant, Pyrrol-Imidazol-Polyamide (PIPs), triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) oder pseudokomplementäre PNAs einzusetzen. Für Letztere war es möglich, eine neue Syntheseroute zu einem Fmoc geschützten Thiouracil-Monomer zu entwerfen. Dabei konnte eine selektive Alkylierung an der N1-Position des Thiouracils durchgeführt werden. Auf Basis der PIPs und der TFOs wurden jeweils verschiedene Adaptoren entworfen, deren Bindung zu ihren Zielen mit Band-Shift-Experimenten und im Fall der PIPs zusätzlich mit fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten gezeigt wurde. Im Rahmen dieser Versuche zeigte sich, dass die PIP-basierten Systeme deutlich besser an die Zielsequenzen banden als die TFO-basierten Adaptoren. Das Konjugat K5a besaß hierbei die besten Eigenschaften. Weiterhin konnte mit diesem Adaptor in Pulldown-Experimenten gezeigt werden, dass Sp1 auf eine nicht kanonische AT-reiche Bindestelle umgeleitet wurde. Im Anschluss konnte das Sp1 in Western-Blots detektiert werden. Des Weiteren ließ sich zeigen, dass K5a in einem HeLa Lysat über mehrere Stunden stabil war und somit eine Anwendung in Zellkulturexperimenten möglich sein sollte. Für die Rekrutierung der RISCs war lediglich eine Erkennung zweier einzelsträngiger RNA-Abschnitte notwendig. Hierzu wurden zwei LNAs oder LNA/DNA-Mixmere verwendet, die über einen Linker verknüpft waren (Abbildung I). Als Folge dieses Aufbaus mussten die beiden Adaptorhälften orthogonal sein, da eine Selbstbindung des Adaptors leichter als bei den TF-Adaptoren auftreten konnte. Diese Adaptoren wurden mit Band-Shift- und fluoreszenzbasierten Pulldown-Experimenten auf ihre Fähigkeit, eine Cy5-gelabelte miRNA auf eine Ziel-RNA umzuleiten, überprüft. Es konnte beobachtet werden, dass all-LNA Adaptoren sehr viele off-target-Effekt aufwiesen, welche die Umleitung von miRNAs verhinderte. Im Gegensatz dazu konnten mit DNA/LNA-Mixmeren eine vollständige Umleitung von miRNA-Modellen beobachtet werden. Es war ebenfalls möglich, spezifische RISCs aus HeLa-Lysaten mit unterschiedlichen Adaptoren in Pulldown-Experimenten zu isolieren und in nachfolgenden Western-Blots zu detektieren. Nachdem gezeigt war, dass eine Umleitung in vitro gelang, sollte die Funktion der Adaptoren in Zellkulturexperimenten geprüft werden. Allerdings konnten in diesen Versuchen keine eindeutigen Ergebnisse erhalten werden, sodass die biologische Relevanz der RISC-Umleitung bislang noch nicht bestätigt werden konnte.
- The control of gene expression is one of the most important goals of chemical biology. According to the classical dogma of molecular biology the flow of genetic information proceeds via transcription from DNA to messenger RNA (mRNA) and through translation from mRNA to proteins. Even though the original dogma was extended in several aspects, there is no change in the central statement. A malfunction of gene expression often causes severe diseases. Classical therapeutics, which are typically small molecules, can bind and inhibit these pathogenic proteins specifically. Nevertheless, these agents interfere at the end of the production chain and there are undruggable proteins. In contrast, an intervention at the level of transcription or translation could reduce the pathogenic proteins to a normal level or prevent their expression completely. As important regulators of gene expression transcription factors (TFs) are interesting targets for transcriptional control. TFs can make contact to further proteins and recruit the RNA-polymerase II and start the transcription of a gene. An important aspect for translation is the half-life of the mRNA. The lifetime is controlled by several proteins and micro RNAs (miRNAs). MiRNAs are short oligonucleotides, which can be incorporated in argonaut proteins. The resulting RNA induced silencing complexes (RISCs) can initiate the degradation of the mRNA. Both TFs and RISCs contain a nucleic acid binding subunit for a sequence specific recognition. In a way, the molecular recognition of nucleic acid is comparable to a post, that is delivered correctly because of its address. To use the same metaphor: In case of a change of residence, a redirection service is usually ordered. Thereby the old address of the post is paste over with a new address label. The central goal of this dissertation is the transfer of this “relabeling” to TFs and RISCs. In this case it is necessary to cover the nucleic acid binding unit, the “old address”, completely and to create a high affinity to a new sequence at the same time. This can be achieved by using bifunctional adaptor molecules. The adaptor molecules for the redirection of TFs must have the ability to bind double stranded DNA (dsDNA) and TFs (Figure I). Thereby, a self-binding must be avoided. In this work the TF Sp1 was chosen as target since it binds to GC-rich dsDNA. This allows the choice of a AT- or GA-rich DNA sequence as target for redirection and minimize the possibility of self-binding. pyrrole-imidazole-polyamides (PIPs), triplex-forming oligonucleotides (TFOs) and pseudo complementary PNAs should be used for the recognition of DNA. For the latter it was possible to create a new synthetic route for a Fmoc protected thiouracil monomer. Thereby, a selective alkylation of the N1-position of thiouracil could be achieved. Based on PIPs and TFOs, several adaptor molecules were created. The binding of the adaptor molecules to their target sequences was shown in band shift assays and in case of the PIP-adaptors by fluorescent based pulldown experiments as well. It turned out that the PIP-adaptors were more effective than the TFO-based systems. Especially the conjugate K5a was very effective. Subsequently, the adaptor was used in pulldown experiments to recruit Sp1 to a non-canonic AT-rich binding-site. This was proofed by a western blot that followed the pulldown. Additionally, it was shown, that K5a was stabile in a HeLa-lysate for several hours, and therefore it is suitable for cell culture experiments. For the recruitment of RISCs, it was necessary to recognize two single stranded RNAs. As a result, the adaptor molecule was compromised of two LNAs or DNA/LNA-mixmers, that were connected by a linker (Figure I). In consequence of the design, the two parts of the adaptor must be orthogonal, since a self-binding was more likely than in the case of the TF-adaptors. Those adaptors were tested in band shift and fluorescent based pulldown experiments on their ability to recruit a Cy5-labed miRNA to a target-RNA. It turned out that the all-LNA-adaptors showed to many off target effects, that limited their abilities to redirect miRNAs. In contrast the DNA/LNA-mixmers showed the expected behavior and a complete redirection of miRNA models. It was also possible to isolate specific RISCs from HeLa lysates in pulldown experiments with multiple adaptors and to detect them in western blots. After the in vitro experiments indicate, that the redirection of RISCs was possible, the concept should be confirmed in cell culture trials. Unfortunately, the results of the cell culture experiments remained unclear and hard to reproduce. Therefore, the biological relevance of the concept could not be confirmed yet.
Author: | Mathias BolzGND |
---|---|
URN: | urn:nbn:de:hebis:30:3-611198 |
DOI: | https://doi.org/10.21248/gups.61119 |
Referee: | Michael GöbelORCiDGND, Alexander HeckelORCiDGND |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Language: | German |
Date of Publication (online): | 2021/06/07 |
Year of first Publication: | 2020 |
Publishing Institution: | Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg |
Granting Institution: | Johann Wolfgang Goethe-Universität |
Date of final exam: | 2021/05/26 |
Release Date: | 2021/08/18 |
Page Number: | 238 |
HeBIS-PPN: | 484462075 |
Institutes: | Biochemie, Chemie und Pharmazie |
Dewey Decimal Classification: | 5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie |
Sammlungen: | Universitätspublikationen |
Licence (German): | ![]() |