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Michela Castellani

• The ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase is a key component of several aerobic respiratory chains in different organisms. It is an integral membrane protein complex, made up of three catalytic subunits (cytochrome b, cytochrome c1 and Rieske iron sulphur protein) and up to eight additional subunits in mitochondria. The complex oxidizes one quinol molecules and reduces two cytochrome c during the Q cycle, originally described by Peter Mitchell. Electrons are split between the low and the high potential chain and protons are released on the positive side of the membrane, increasing the protonmotive force needed by the ATP-synthase for energy transduction. The cytochrome bc1 complex from P. denitrificans is a perfect model for structural and functional studies. Bacteria are easy to grow and the genetic material is readily accessible for genetic manipulation. Moreover, the P. denitrificans aerobic respiratory chain is very close to the mitochondrial one: the complexes involved in electron transfer resemble the ones found in mitochondria, but lack most of the additional subunits. As a unique feature, P. denitrificans has a strongly acidic domain at the N-terminal region of the cytochrome c1, a sequence of 150 aminoacids which does not correlate with any known protein. An analogous composition can be found in the eukaryotic cytochrome bc1 complex as a part of an accessory subunit, proposed to be involved in facilitating electron transfer between the complex and the electron acceptor cytochrome c. In order to study the function of this domain in the P. denitrificans cytochrome bc1 complex, a deletion mutant has been previously cloned and modified with an affinity tag as a C-terminal extension of cytochrome b. The complex is purified by affinity chromatography and characterized by steady-state kinetics using not only horse heart cytochrome c but also the endogenous electron acceptor, the membrane bound cytochrome c552, employed here as a soluble fragment. Steady–state kinetics indicate that the deletion of the long acidic domain had effects neither on the turnover rate nor on the apparent affinity for the substrate. To understand wether the deletion affects the reaction between the cytochrome bc1 complex and the substrate, laser flash photolysis experiments are performed, showing that the interaction observed was not changed in the complex missing the acidic domain. The results presented in this work confirm the ones previously obtained by Julia Janzon using soluble fragments of the same interaction partners. The deletion, however, affected the oligomerization state of the complex, as shown by LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ion Desorption) analysis. The wild type complex has a tetrameric structure, better described as a “dimer of dimers”. The deletion of the acidic domain on the cytochrome c1 results in the separation of the two dimers, yielding the canonical dimer. Therefore, the complex deleted in the acidic domain is used for cloning and expression of a heterodimeric complex, containing an inactivating mutation in the quinol oxidation site in only one monomer, thus allowing a selective switch-off for half the complex. Such a complex is needed for the verification of an internal regulation mechanism, the half-of-the-sites reactivity. According to it, the dimeric structure of the cytochrome bc1 complex has functional implications, since the two monomers can communicate and work in a coordinated manner. This approach confirms that substrate oxidation does effectively take place only in one of the two monomers constituting the dimer, and that the binding of substrate at the Qo and Qi site regulates the switch between active and inactive monomer. Moreover, this mechanism works also as an effective protection against the reaction of quinone intermediates with oxygen and the formation of reactive oxygen species (ROS), responsable for cellular aging. The motion of the ISP head domain is also addressed in this work; in particular the mechanism which regulates the movements towards the cytochrome c1 and the electron bifurcation at the quinol oxidation site. Laser flash kinetics in presence of several inhibitors and the substrate allow studying the response of the ISP to the binding of different species at the quinol oxidation site. The binding of ligand at the Qo site in the complex triggers the conformational switch in the ISP head domain, supporting the mechanism proposed in the literature according to which the Qo site is able to “sense” the presence of substrate and transfer the information to the ISP, regulating its mobility. The internal electron pathway between the ISP and the cytochrome c1 has been analyzed also by stopped-flow kinetics, in presence and absence of inhibitors. The results indicate that two kinetic phases describe the reduction of cytochrome c1 by the ISP, and a model for the simulation of the data is proposed.
• Der Cytochrom bc1 Komplex ist der zentrale Membranproteinkomplex der aeroben Atmungsketten vieler Organismen. Er besteht aus den drei redox-aktiven Untereinheiten Cytochrom b, Cytochrom c1 und dem Rieske Eisen-Schwefel-Protein (ISP), sowie speziesabhängig aus bis zu acht weiteren akzessorischen Untereinheiten. Der Komplex oxidiert in einem kompletten katalytischen Zyklus zwei Chinol-Moleküle und reduziert hierbei zwei Cytochrom c und ein Chinon zu Chinol. Der in dieser Arbeit untersuchte Cytochrom bc1 Komplex des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans stellt aus mehreren Gründen ein geeignetes Studienobjekt dar: einerseits ist die aerobe Atmungskette dieses Bakteriums der der eukaryontischen Mitochondrien sehr ähnlich, jedoch vielfach als Minimal-Komplex aufgebaut aus den essentiellen Untereinheiten. Das Bakterium ist überdies im Labor gut zu kultivieren, die genetische Information durch etablierte Verfahren zugänglich, und gentechnische Veränderungen lassen sich im Vergleich zu Eukaryonten einfacher einfügen. Der Cytochrom bc1 Komplex von P. denitrificans weist im Cytochrome c1 jedoch einen einzigartigen Unterschied zu anderen Komplexen auf. Er enthält am N-Terminus einen Einschub von 150 Aminosäuren, die zu 40 % saure Seitengruppen tragen. Für diese Domäne können aufgrund ihres ungewöhnlichen Aminosäure-Gehalts keine Sekundärstrukturen vorhergesagt werden. Eine ähnliche Zusammensetzung, mit hohem Anteil an sauren resten, findet sich in einer der akzessorischen Untereinheiten der eukaryontischen Komplexe, für die vorgeschlagen wurde, dass sie im Elektronentransfer die wichtige Ausrichtung des Cytochroms c fördert. In dieser Arbeit wird deshalb eine Variante des P. denitrificans Komplexes ohne die saure Domäne (“ac“), jedoch mit einem C-terminalen His-tag am Cytochrom b, untersucht. Die ac Variante des Komplexes wurde aufgereinigt und die Enzymaktivität mit ihren Michaelis-Menten-Parametern bestimmt. Die Deletion dieser großen Domäne hat keinen Einfluss auf die Enzymaktivität, unabhangig davon, ob mit dem nativen oder dem in den Standardäktivitätstest häufig verwendeten Cytochrom c aus Pferdeherz gemessen wurde. Zur Untersuchung der Elektronentransferprozesse und der für die Substratbindung beteiligten Ladungen wurden schnelle Kinetiken mit Hilfe der Methode der Laserblitz-Photolyse aufgenommen. In diesen Untersuchungen wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt, so konnte zwischen Wildtyp und Variante kein Unterschied in den Brønstedt-Graphiken festgestellt werden, die die Zahl der an Interaktion beteiligten Ladungen definieren. In einer weiteren Studie mit Hilfe der LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ion Desorption)-Massenspektroskopie stellte sich heraus, dass der Unterschied zwischen Wildtyp und Variante in einem unterschiedlichen Oligomerisierungszustand liegt. Der Wildtyp liegt als Tetramer (Dimer aus zwei funktionellen Dimeren) vor, die ac Varianten als funktionelles, für Cytochrome bc1 Komplexe typischerweise beschriebenes Dimer. Dieser Befund machte es möglich, in einem weiteren Projekt einen heterodimeren Komplex zu konstruieren, der durch eine Tandemaufreingung mittels zweier verschiedener Affinitäts-tags isoliert werden konnte. Dies war vorher aufgrund des tetrameren Assoziationszustandes nicht gelungen. Für dieses Projekt wurde ein heterodimerer Komplex benötigt, der in einem Monomer dem Wildtyp entspricht und mit dem Strep-tag versehen ist und im anderen Monomer eine inaktivierende Mutation im Cytochrom b einführt und diese mit dem His-tag markiert. Die zur Kennzeichnung eingefügten tags wurden C-terminal am Cytochrom b angebracht. Die Elektronenübertragung zwischen dem Rieske-Protein und dem Cytochrom c1 ist an eine vorherige Bewegung des Rieske-Proteins gekoppelt; von seiner Position am Cytochrom b, wo es zunächst an der Oxidation des Chinols beteiligt ist und reduziert wird, bewegt es sich zum Cytochrom c1, und reduziert es. Die Elektronenbifurkation, der Auslöser für die Ablösung vom Cytochrom b und für die Bewegung mit nachfolgender Reduktion des Cytochrom c1 ist in dieser Arbeit mit Laserblitz-Photolyse und Stopped Flow-Experimenten untersucht, um ein breites Zeitfenster abzudecken. Die intrinsische Regulation der Elektronenbifurkation zwischen der Hoch- und Niedrigpotentialkette und deren Mechanismus und zeitlicher Ablauf werden ebenfalls seit geraumer Zeit in der Literatur diskutiert. In dieser Arbeit wurde die Rolle untersucht, welche die saure Domäne im Cytochrom bc1 Komplex von P. denitrificans spielt. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz nicht am Elektronentransfer zwischen dem Cytochrom bc1 Komplex und dem Cytochrom c beteiligt ist, möglicherweise aber für die Interaktion in anderen Stoffwechselwegen in P. denitrificans wichtig ist. Die Deletion führt zu einer Veränderung des Oligomerisierungzustandes des Komplexes und erlaubt die Verwendung der ac Variante für die Validierung des half-of-the-sites Mechanismus. Durch die Bindung von Chinol am Qi Zentrum wird die Aktivierung der Chinol-Oxidation auf einem oder auf beiden Monomeren des Cytochrom bc1 Komplexes ausgeübt. Die kinetische Untersuchungen zeigen auch, dass die Bindung von Substrat im Qo Zentrum nicht nur die Voraussetzung für die Katalyse ist; sie kontrolliert auch einen Mechanismus, der die Bewegligkeit des Rieske Proteins reguliert.