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Jan-Hendrik Rohde

• Ischemic injuries of the cardiovascular system are still the leading cause of death worldwide. They are often accompanied by loss of cardiomyocytes (CM) and their replacement by non-functional heart tissue. Cardiac fibroblasts (CF) play a major role in the recovery after ischemic injury and in the scar formation. In the last few years researchers were able to reprogram fibroblasts into CM in vitro and in murine models of myocardial infarction using various protocols including a cocktail of microRNAs (miRs). These miRs can target hundreds of messenger RNAs and inhibit their translation into proteins, potentially regulating multiple cellular signaling pathways. Because of this, there has been a rising interest in the use of miRs for therapeutic purposes. However, as different miRs have different effects in different cells, there is the danger of causing serious side effects. These could be alleviated by enacting a cell-specific transport of miRs, for example by using aptamers. Aptamers are usually short strands of DNA or RNA, which can fold into a specific three-dimensional confirmation which allows them to bind specifically to target molecules. Aptamers are commonly selected from a large library for their ability to bind to target molecules using a procedure called SELEX. Aptamers have already been used to transport miRs into cancer cells. In this thesis, we first established the transport of miRs into cells of the cardiovascular system using aptamers. MiR-126 is an important part of the signaling in endothelial cells (EC), protects from atherosclerosis and supports angiogenesis, which is why we chose it as a candidate to transport into the vasculature. We first tested two aptamers for their ability to internalize into EC and fibroblasts. Both the aptamer for the ubiquitously expressed transferrin receptor (TRA) and a general internalizing RNA motif, but not a control construct, could internalize efficiently into all cell types tested. We then designed three chimeras (Ch) using different strategies to connect TRA to miR-126. While all chimeras could internalize efficiently, only Ch3, which connects TRA to Pre-miR-126 using a sticky bridge structure, had functional effects in EC. Ch3 reduced the protein expression of VCAM-1 in EC and increased the VEGF induced sprouting of EC in a spheroid-sprouting assay. Treatment of breast cancer cells with Ch3 emulated the effects of treatment with classical miR-126-3p and miR-126-5p mimics. In the SK-BR3 cell line Ch3 and miR-126-3p reduce the viability of the cells while they reduce recruitment of EC by the MCF7 cell line. miR-126-5p had no apparent effect in the SK-BR3 line, but increased viability of MCF7 cells, as did Ch3. This implies that Ch3 can be processed to both functional miR-126-3p and miR-126-5p in treated cells. We were unable to achieve a reprogramming of adult murine cardiac fibroblasts into cells resembling CM using the cocktail of 4 miRs. This indicates that the miR-mediated transdifferentiation is only possible in neonatal fibroblasts. The effects in mice after an AMI might possibly be caused by an enhanced plasticity of fibroblasts in and close to the infarcted area. We also screened to find aptamers specifically binding to cells of the cardiovascular system. We used two oligonucleotide libraries in a cell-SELEX to select candidates which bind to CF, but not EC. We observed that only the library which contains two randomized regions of 26 bases showed an enrichment of species binding to fibroblasts. We then sequenced rounds 5-7 of the SELEX and analyzed the data bioinfomatically to select 10 candidate aptamers. All candidates showed a strong binding not only to CF, but also EC. This indicates that the selection pressure against species binding to EC was not high enough and would have to be increased to find true CF-aptamers. Four promising candidates were also analyzed for their potential to be internalized and we surprisingly found that all of them were internalized by EC and CF more efficiently than TRA. The similar behavior of the candidates implies that they possibly share a ligand, which is expressed both by EC and CF, but more prominently by the latter. This work demonstrates the possibility of using aptamers to transport miRs into cells of the cardiovascular system. It also shows that it is possible to select aptamers for non-cancerous mammalian cells, which has not been done before. It is reasonable to assume that a refinement of the cell-SELEX will allow selection of cell-specific aptamers. Due to the failure of reprogramming of adult fibroblasts into induced cardiomyocytes we were unable to test whether a miR-mediated reprogramming might be inducible using aptamer transported-miRs. Ultimately, aptamer mediated transport of miRs is a feasible and promising therapeutic option for the treatment of cardiovascular diseases and other disorders like cancer.
• Ischämische Erkrankungen des Herz-Kreislaufsystems sind immer noch die führende Todesursache in den Ländern der westlichen Welt. Ein dabei häufig auftretendes Problem ist der Verlust funktioneller Herzmuskelzellen und deren Ersatz mit nicht-funktionellem Narbengewebe. Kardiale Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle bei dieser Narbenbildung. In den letzten Jahren konnten Forscher erfolgreich eine Reprogrammierung dieser Fibroblasten zu Herzmuskelzellen in Kultur und auch in in Mausmodellen von Herzinfarkt bewerkstelligen, unter anderem mit Hilfe von MicroRNAs (miRs). Diese miRs können potentiell hunderte verschiedene messenger RNAs ansteueren und deren Translation in Eiweiße inhibieren, wodurch miRs ganze zelluläre Signalwege regulieren können. Darum kam in den letzten Jahren ein immer größeres Interesse auf, miRs für die Therapie von vielen Krankheiten, unter anderem vaskuläre Erkrankungen und Krebs, einzusetzen. Auf Grund der unterschiedlichen Effekte von miRs, die abhängig von den verschiedene Zell-oder Gewebetypen sind, besteht allerdings ein großes Risiko von unerwünschten Nebenwirkungen. Diese könnten durch einen zielspezischen Transport von miRs, z.B. durch die Verwendung von Aptameren, verhindert werden. Aptamere sind meist kurze Stränge aus DNA oder RNA, welche sich zu drei-dimensionalen Strukturen falten, durch welche sie spezifisch an Zielmoleküle binden. Aptamere werden mittels einem Verfahren namens SELEX aus einer großen Bibliothek von möglichen Sequenzen auf ihre Fähigkeit, an Zielmoleküle zu binden, ausgewählt. Einige miRs wurden bereits mittels Aptamere in Krebszellen transportiert. In dieser Doktorarbeit wurde zuerst der Transport von funktionellen miRs in Zellen des kardiovaskulären Systems etabliert. MiR-126 ist ein wichtiger Bestandteil der Signalwege von Endotheelzellen (EZ), schützt vor Atherosklerose und unterstützt die Angiogenese, weshalb wir es als Kandidat für den Transport mittels Aptamer in Zellen auswählten. Zuerst wurden zwei Aptamere auf Ihre Fähigkeit getestet, in EZ und Fibroblasten zu gelangen. Sowohl der Aptamer für den ubiquitär exprämierten Transferrin Rezeptor (TRA) als auch das generelle internalisierende RNA Motif, aber nicht ein Kontrollkonstrukt von gleicher Länge, internalisierten effizient in allen genutzten Zelltypen. Danach wurden drei Chimären getestet, welche verschieden Strategien nutzen um TRA und miR-126 zu verbinden. Obschon alle drei Chimären effizient in EZ internalisieren, zeigte nur die Chimäre 3 (Ch3) in welcher das TRA und der Precursor von miR-126 mittels einer klebrigen Brückensequenz verbunden sind funktionelle Effekte. Ch3 verringerte die Eiweißexpression von VCAM-1 in EZ und verstärkte außerdem die VEGF-induzierte Sproßung von EC in einem Sphäroid-Sproßungs-Assay. Des Weiteren zeigte die Behandlung von Bruskrebszellen mit Ch3 dieselben Effekte wie eine Behandlung mit klassischen Mimetika von miR-126-3p und 5p. In der SK-BR3 Zellinie verursachte Ch3 und miR-126-3p eine Abnahme der Vitalität während in der MCF7 Zellinie die Rekrutierung von EZ zu den Krebzellen abnahm. MiR-126-5p hatte keinen offensichtlichen Effekt auf die SK-BR3 Zellinie, verursachte aber ebenso wie Ch3 eine Zunahme der Vitalität in der MCF7-Linie. Dies impliziert, dass Ch3 in Zellen sowohl zu funktioneller miR-126-3p als auch miR-126-5p prozessiert werden kann. Es war uns nicht möglich eine Reprogrammierung von kardialen Fibroblasten aus erwachsenen Mäusen zu herzmuskelzellähnlichen Zellen mittels miRs zu erwirken. Dies deutet darauf hin, dass miR gesteuerte Reprogrammierung nur in Fibroblasten von neugeborenen Mäusen in Zellkultur sowie in erwachsenen Mäusen nach einem Infarkt erfolgen kann. Außerdem haben wir ein Screening durchgeführt um Aptamere zu finden, welche an Zellen aus dem kardiovaskulären System, im speziellen kardiale Fibroblasten, binden. Wir benutzten zwei verschiedene Aptamer-Bibliotheken in einem Zell-SELEX Verfahren um Oligonukleotide anzureichern, welche an kardiale Fibroblasten aber nicht an EC binden. Wir sahen, dass lediglich die Bibliothek mit zwei Bereichen aus 26 randomisierten Nukleotiden zu einer Anreicherung von Spezies führt, die an Fibroblasten binden. Die letzten drei Runden dieser Zell-SELEX wurden im Anschluß sequenziert. Nach einer ausgiebigen bioinformatischen Analyse wurden zehn mögliche Kandidaten auf Ihre Fähigkeit, an kardiale Fibroblasten zu binden, untersucht. Alle Kandidaten konnten mit unterschiedlicher Effizienz sowohl an kardiale Fibroblasten als auch EC binden. Daraufhin wurden die vier vielversprechendsten Kandidaten auf ihre Fähigkeit zur Internalisierung in Fibroblasten und EC überprüft und waren alle in der Lage, in beide Zelltypen zu internalisieren. Hierbei zeigten sie sogar mehr Effizienz als TRA bei gleicher Konzentration. Zusammen genommen demonstriert diese Doktorarbeit, dass Aptamere genutzt werden können um funktionelle microRNAs in das kardiovaskuläre System zu transportieren. Sie zeigt auch, dass es möglich ist Aptamere für gesunde Säugetier-Zellen zu selektieren, was zuvor noch nicht beschrieben wurde. Da wir keine Reprogrammierung von Fibroblasten durch miRs hervorrufen konnten war es uns leider nicht möglich, zu testen ob Aptamere als Träger im Rahmen einer solchen Reprogrammierung geeignet sind. Dennoch deuten unsere Daten darauf hin, dass Aptamer medierter Transport von microRNAs eine mögliche und vielvesprechende Option für die Behandlung von kardiovaskulären und anderen Erkrankungen ist.