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Florian Csintalan

• The centerpiece of all neuronal processes is the synaptic transmission. It consists of a complex series of events. Two key elements are the binding of synaptic vesicles (SV) to the presynaptic membrane and the subsequent fusion of the two membranes. SV are neurotransmitter-filled membranous spheres with many integral and peripheral proteins. The synaptic SNARE complex consists of three interacting proteins, which energize and regulate the fusion of the SV membrane with the presynaptic membrane. Both processes are closely orchestrated to ensure a specific release of neurotransmitter. Already many experiments have been performed, such as genetic screens and proteome analysis of SV, to determine the functions of the various proteins involved. Nevertheless, the functions of the identified proteins are still not fully elucidated. The aim of this thesis was initially applying a tandem affinity purification (TAP) of SV to identify unknown interaction partner of SV and to determine their role. This was supposed to be performed in the model organism Caenorhabditis elegans (C. elegans). The underlying mechanisms are conserved throughout the phylogentic tree and identified interaction partners will help to understand the processes in the mammalian brain. Although there is no neuron-rich tissue in C. elegans as in other model organisms, the diverse genetic methods allows a rapid creation of modified organisms and a prompt determination of the function of identified proteins. The integral SV protein synaptogyrin has been fused to a TAP-tag. The TAP-tag consists of a ProteinA, a TEV protease cleavage site and a calmodulin binding peptide (CBP). Both affinity purification steps are performed sequentially and allow a highly specific native purification of proteins and their interaction partners. Due to technical difficulties the purification strategy was modified several times during the course of this thesis and then finally abandoned for a more promising project, the SNARE complex purification. In conclusion, one of the reasons was the necessary lack of detergent. The amended aim of this thesis has been the TAP of solubilized SNARE complex to identify unknown interaction partner and to determine their role. In order to increase the specificity of the purification, in terms of formed complexes, the two SNARE subunits, synaptobrevin (SNB-1 in C. elegans) and syntaxin (UNC-64 in C. elegans), were separately fused to the different affinity tags. As the modifications of the proteins could impair their function and lead to false interaction partners, their functionality was tested. For this purpose, the corresponding fusion constructs were expressed in strains with mutated snb¬1 and unc-64. Non-functional synaptic proteins display an altered course of paralysis in an aldicarb assay. The fusion proteins which were expressed in their respective mutant strains displayed a near to wild-type (WT) behavior in contrast to the naive mutant strains. Multiple TAP demonstrated SNB-1 signals in Western blot analysis and complex sets of proteins in the final elution step in a silver staining of SDS-PAGEs. These samples were sent with negative control (WT purification) for MS analysis to various cooperation partners. 119 proteins were identified which appeared only in data sets with SNARE proteins and not in WT samples. If proteins were detected in ≥ 2 SNARE positive MS analysis and had known neural functions or homologies to neuronal proteins in other species, they were selected for further analysis. These candidates were knocked down by RNAi and tested for synaptic function in a following aldicarb assay. The treatment with their specific RNAi resulted for mca-3 in a strong resistance, while frm-2, snap-29, ekl-6, klb-8, mdh-2, pfk-2, piki-1 and vamp-8 resulted in hypersensitivity. The most responsive genes frm-2, snap-29 and mca-3 were examined, whether they displayed a co-localization together with synaptobrevin in promoter fusion constructs or functional fusion constructs. In fluorescence microscopy images only MCA-3::YFP demonstrated neuronal expression. In order to substantiate the synaptic nature and functionality of the MCA-3::YFP a swimming assay was performed. Here, fusion construct expressing strains, which contained mutated mca-3, were compared with untreated mutant strains and WT strains according to their behavior. In this swimming assay a partial restoration of WT behavior was shown in the MCA-3::YFP expressing mutant strains. Based on these data, we discovered with MCA 3 a new interaction partner of the SNARE complex. MCA-3 is a plasma membrane Ca2+-ATPase and was initially seen only in their role in the endocytosis. Its new putative role is the reduction of Ca2+ concentration at the bound SNARE complex. Since an interaction of syntaxin with Ca2+ channels has been demonstrated, it would be comprehensible to reduce the local concentration of Ca2+ to a minimum by tethering Ca2+ transporters to the SNARE complex.
• Das Kernstück aller neuronalen Vorgänge ist die Synaptische Transmission. Sie besteht aus einer Abfolge von Prozessen. Zwei sind die Bindung von synaptischen Vesikeln (SV) an die präsynaptische Membran und die Fusion beider Membranen mittels des SNARE-Komplexes. Synaptische Vesikel sind neurotransmitter-gefüllte Membrankugeln mit einer Vielzahl von Proteinen. Die Funktionen der SV sind die Konzentration, Lagerung und Organisation der Neurotransmitter. Außerdem erlaubt ihre Interaktion mit Proteinen eine regulierte Freisetzung ihrer Neurotransmitter. Der synaptische SNARE-Komplex besteht aus drei Proteinen: Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP-25. Um Membranen zu fusionieren muss die die Abstoßungskraft der Kopfgruppen der Lipid-Doppelschichten überwunden werden. Die Bildung eines SNARE coiled Coil liefert die Energie hierfür. Die Fusion wird engmaschig kontrolliert, um die Spezifität der Neurotransmitterausschüttung zu gewährleisten. Es wurden bereits viele Experimente durchgeführt um die beteiligten Proteine zu bestimmen. Nichtsdestotrotz sind diese Prozesse noch immer nicht abschließend geklärt. Ziel dieser Arbeit war es mithilfe einer Tandem-Affinität-Aufreinigung (TAP) von SV unbekannte Interaktionspartner zu bestimmen. Dies sollte in Caenorhabditis elegans (C. elegans) durchgeführt werden. Da die Mechanismen evolutionär konserviert sind, lassen sich durch Entdeckungen im Nematoden Rückschlüsse auf Vorgänge im menschlichen Nervensystem ziehen. Zwar ist in C. elegans kein neuronenreiches Gewebe vorhanden, aber es existieren vielfältige genetische Methoden. Diese erlauben eine zügige Bestimmung der Funktion identifizierter Proteine. Dazu wurde das SV-Protein Synaptogyrin mit einem TAP-tag versehen. Der Tag besteht aus einem ProteinA, einer Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease-Schnittstelle und einem Calmodulin-Binde-Peptid (CBP). Die beiden Aufreinigungsschritte werden nacheinander durchgeführt. Dies sollte es erlauben intakte SV in hoher Reinheit nativ zu gewinnen. Mit-aufgereinigte Proteine können mit Hilfe massenspektrometrischer (MS) Methoden identifiziert werden. Zwar gelang es in verschiedenen Aufreinigungen Synaptogyrin in geringe Mengen von IgG-Beads zu eluieren, eine quantitative Elution konnte jedoch nicht erreicht werden. Aus diesem Grund wurde die Aufreinigungsstrategie im Laufe der Arbeit mehrfach modifiziert. Diese Ansätze verbesserten die Elution nicht und so wurde dieses Projekt für die SNARE-Komplex-TAP aufgegeben. Vermutlich war einer der Gründe für den Misserfolg der SV-Aufreinigung der notwendige Verzicht auf Detergenz. Neues Ziel dieser Arbeit war es mit der TAP unbekannte Interaktionspartner des SNARE-Komplexes zu identifizieren. In dieser neuen Aufreinigungsstrategie konnte Detergenz verwendet werden. Um die Spezifität der Aufreinigung in Hinblick auf gebildete Komplexe zu erhöhen, wurden die Tags auf Synaptobrevin und Syntaxin verteilt. Triton X-100 und eine differenzielle Zentrifugation wurden als erfolgversprechendste Bedingungen identifiziert. Mehrere TAP zeigten im finalen Elutionsschritt ein SNB-1-Signal im Western blot und Proteinsignale im Silver Stain. Diese Proben wurden zusammen mit Wildtypproben zur MS-Analyse an Kooperationspartner gesandt. Bei Beschränkung auf Datensätze, die SNARE-Proteine enthielten und nicht in Wildtyp-Proben auftauchten, wurden insgesamt 119 Proteine. Aus diesen Proteinen wurden Kandidaten zur weiteren Analyse ausgewählt, wenn sie in mindestens zwei SNARE-positiven MS-Analysen detektiert wurden oder bekannte neuronale Funktionen oder Homologien zu neuronalen Proteinen in anderen Spezies aufwiesen. Diese Kandidaten wurden mithilfe eines RNAi Knock-downs und Aldicarb Assay auf ihre synaptische Funktionen untersucht. Der knock-down löste bei mca-3 eine starke Resistenz aus, während frm-2, snap-29, ekl-6, klb-8, mdh-2, pfk-2, piki-1 und vamp-8 in einer Hypersensitivität mündeten. Die am stärksten reagierenden Gene frm-2, snap-29 und mca-3 wurden untersucht, ob sie eine Kolokalisation mit Synaptobrevin zeigten. Während FRM-2::GFP und SNAP-25::GFP keine neuronal-spezifischen Signale aufwiesen, konnte für MCA-3::YFP in Fluoreszenz¬mikroskop¬aufnahmen eine neuronale Expression nachgewiesen werden. Um den synaptischen Charakter zu zeigen, wurde ein Schwimm Assay mit MCA-3::YFP-exprimierende Mutantenstämmen durchgeführt. Es konnte eine partielle Wiederherstellung gezeigt werden. Aufgrund unserer Daten sind wir überzeugt mit MCA-3 einen Interaktionspartner des SNARE-Komplexes entdeckt zu haben. MCA-3 ist eine Plasmamembran Ca2+-ATPase und wurde bisher nur in ihrer Rolle in der Endozyose gesehen. Ihre mutmaßliche Rolle ist die Senkung der Ca2+-Konzentration am SNARE-Komplex. Da schon eine Interaktion von SNARE-Syntaxin mit Ca2+-Kanälen gezeigt wurde, ist es nur verständlich mithilfe einer Interaktion auch Ca2+-Transporter zu kolokalisieren um die Konzentration von Ca2+ vor Ort auf ein Minimum zu senken. So werden schnell neue Transmissionen ermöglicht.