Open Access

Marie-Luise Herrlein

• Zika-virus (ZIKV), a flavivirus mainly transmitted by Aedes mosquitoes, is a single-stranded, positive-sense RNA virus. The viral genome is surrounded by a nucleocapsid and a lipid bilayer, in which membrane and envelope proteins are embedded. ZIKV disease is mainly characterized by mild symptoms, such as fever, rash as well as pain in head and joints. However, after epidemics it caused in the Americas in 2015/16, ZIKV infections were also associated with severe neurological complications like the Guillain-Barré syndrome (GBS) and microcephaly in fetuses and newborns. So far there are no specific antiviral treatments or vaccines available against ZIKV. This strengthens the need for a detailed understanding of the viral life cycle and virus-host interactions. The antiviral host factor tetherin (THN) is an interferon-stimulated protein and therefore part of the cellular innate immune response. It comprises an N-terminal cytoplasmic domain, followed by a transmembrane helix, an extracellular coiled-coil domain and a C-terminal glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Containing two sites for membrane insertion linked by a flexible structure, THN is able to integrate into the membrane of budding viruses, thereby attaching them to each other and to the cell membrane and preventing their further release and spread. In this study, the crosstalk of ZIKV and THN was analyzed. Previous gene expression analyses by microarray and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) had revealed a strong upregulation of the BST2 gene encoding for THN in ZIKV-infected cells. However, this enhanced expression did not correlate with an enhanced THN protein level. On the contrary, the amount of THN in THN-overexpressing cells was after infection even heavily reduced. Furthermore, immunofluorescence analyses revealed a loss of THN membrane localization in these cells. By performing a cycloheximide assay, this loss could be traced back to a reduced protein half-life of THN in infected versus uninfected cells. Treatment with inhibitors of different protein degradation pathways as well as colocalization analyses with markers of several subcellular compartments indicated an involvement of the endo-lysosomal route. A knock-down of the ESCRT-0 protein HRS however prevented the sorting of THN for lysosomal degradation and led to a stabilization of THN protein levels. After HRS depletion, the release and spread of viral particles was reduced in THN-overexpressing compared to wildtype cells. Taken together, the data obtained in this study revealed the potential of THN to restrict ZIKV release and spread. The enhanced degradation of THN in ZIKV-infected cells via the endo-lysosomal pathway could therefore be explained as an effective viral escape strategy. This could be circumvented by knockdown of the ESCRT-0 protein HRS, which highlighted HRS as a potential target for the development of antiviral treatments.
• Das Zika-Virus (ZIKV), ein durch Mücken der Gattung Aedes übertragenes Flavivirus, umfasst ein einzelsträngiges RNA-Genom mit positiver Polarität, das von einem Nukleokapsid, sowie einer von Membran- und Glykoproteinen durchzogenen Lipid-Hülle umgeben ist. Eine durch ZIKV hervorgerufene Erkrankung ist vornehmlich durch milde Symptome wie Fieber, Hautreizungen sowie Kopf- und Gliederschmerzen charakterisiert. Besondere Aufmerksamkeit erregte das Virus jedoch 2015/16 bei einer Epidemie in Nord- und Südamerika. ZIKV-Infektionen wurden dabei erstmals auch mit schwerwiegenden neuronalen Schädigungen, wie dem Guillain-Barré-Syndrom und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen, in Verbindung gebracht. Bislang sind keine spezifischen antiviralen Behandlungen oder Impfstoffe gegen ZIKV verfügbar. Die genaue Charakterisierung des ZIKV-Lebenszyklus sowie Virus-Wirts-Interaktionen ist daher von essentieller Bedeutung. Das antivirale Wirtsprotein Tetherin (THN) bildet als Interferon-induziertes Protein einen Teil der angeborenen zellulären Immunantwort und hindert als solcher die Freisetzung einer großen Bandbreite umhüllter Viren. Die Proteinstruktur von THN umfasst eine N-terminale zytoplasmatische Domäne, gefolgt von einer Transmembranhelix und einem extrazellulären Coiled-Coil-Motiv. Am C-Terminus befindet sich zudem ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker), der eine zweite Membraninsertion ermöglicht. THN kann somit in die Membran abknospender Viren integrieren und sie aneinander oder an die zelluläre Membran anheften, wodurch die weitere Freisetzung und Ausbreitung verhindert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die wechselseitige Interaktion von ZIKV und THN untersucht. Genexpressionsanalysen mittels Mikroarray und quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) hatten zuvor in ZIKV-infizierten Zellen eine starke Induktion der Expression des BST2-Gens, welches für THN kodiert, gezeigt. Diese verstärkte Expression ging jedoch nicht mit einer erhöhten Menge an THN auf Proteinebene einher. Stattdessen war die Proteinmenge von THN nach Infektion sogar in THN-überexprimierenden Zellen stark reduziert. Immunfluoreszenz-Analysen zeigten dabei zudem einen Verlust der THN-Membranlokalisation. Der Verlust von THN konnte mittels Cycloheximid-Assay auf eine verkürzte Protein-Halbwertszeit in ZIKV-infizierten Zellen zurückgeführt werden. Behandlungen mit Inhibitoren verschiedener Abbauwege, sowie Kolokalisationsanalysen mit Markern verschiedener subzellulärer Kompartimente wiesen zudem auf eine Rolle des endo-lysosomalen Weges hin. Durch Knock-down des ESCRT-0-Proteins HRS konnte schließlich die Einsortierung von THN für den endo-lysosomalen Abbau verhindert und das THN-Protein-Level somit stabilisiert werden. In THN-überexprimierenden Zellen resultierte nach HRS-knockdown eine Reduzierung der Freisetzung und Ausbreitung viraler Partikel. Somit konnte in dieser Arbeit das Potential von THN, die Freisetzung und Ausbreitung von ZIKV zu inhibieren, gezeigt werden. Der verstärkte endo-lysosomale Abbau von THN in ZIKV-infizierten Zellen ließ sich daher als effektive virale Immunevasions-Strategie einordnen. Dieser Mechanismus konnte durch einen Knock-down des ESCRT-0-Proteins HRS gehemmt werden, wodurch HRS als mögliches Ziel für die Entwicklung antiviraler Therapien identifiziert wurde.