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Srinath Ramkumar

• Heart development is a dynamic process modulated by various extracellular and intracellular cues. Cardiac progenitors in vertebrates such as the zebrafish, migrate over to the midline after differentiation from the epiblast (Bakkers, 2011; Rosenthal & Harvey, 2010; Stainier et al., 1996; Trinh & Stainier, 2004). These progenitors form a cardiac disc at the midline which elongates into the linear heart tube. The differentiation and migration of cardiac precursors is modulated by signaling interactions between cardiac precursor cells and their extracellular environment known as the Extracellular Matrix (ECM). Studies have shown that Cell-ECM interactions play a crucial role in sculpting the heart during early morphogenic events (Davis CL, 1924; Männer & Yelbuz, 2019; Rosenthal & Harvey, 2010). One key factor to these processes is the presence of a specialized ECM known as the Basement Membrane (BM). Extracellular basement membrane proteins such as Fibronectin have been shown to modulate these very early migration processes of the cardiomyocyte progenitors (Trinh & Stainier, 2004). As the heart develops further, the linear heart tube is composed of myocardial cells with an inner endothelial cell lining separated by a layer of thick jelly like substance called the cardiac jelly (Barry A, 1948; Davis CL, 1924; Little et al., 1989). The cardiac jelly also called the cardiac basement membrane, has been shown to regulate distinct developmental events during cardiogenesis. This early CJ contains components of the basal lamina such as laminins, fibronectin, hyaluronan as well as non-fibrillar collagens such as Collagen IV (Little et al., 1989). In this study, I aimed to identify ECM molecules of the Basement Membrane in the heart and identify their role in the modulation of cardiac development and regeneration using the zebrafish as my model organism. I identified genes belonging to the Zebrafish Matrisome expressed during cardiac developmental and regeneration and performed CRISPR/Cas9 sgRNA mediated mutagenesis. I also developed overexpression tools for these genes. Agrinp168 mutants exhibited no obvious gross morphology defects during cardiac development and were adult viable. Adult mutants exhibited reduced cardiomyocyte proliferation, but no significant difference in cardiomyocyte dedifferentiation post cardiac cryoinjury. Decorin overexpression through mRNA injections led to increased myocardial wall thickness and DN dcn overexpression through mRNA injections led to loss of cardiac looping during early development. Mutants for Small Leucine Rich Proteoglycan (SLRP) prelp generated using CRISPR/Cas9 mutagenesis exhibited cardiovascular defects. Close observation of prelp mutant hearts revealed a reduced heart rate and impaired fractional shortening of the ventricle. prelp mutants exhibited an enlarged atrium at 48 hpf and 72 hpf as well as a reduced ventricle size at 72 hpf. Chamber size in the mutant hearts were enlarged irrespective of contractility of the heart. Mutants showed an increased number of Atrial cardiomyocytes, but no change in cell size. On the molecular level, extracellular Laminin localization was disrupted in prelp mutants along with an increase in thickness and volume of the cardiac HA in the CJ suggesting a potential compensatory role, or retention of immaturity of the cardiac jelly in the prelp mutants. Transcriptomics analysis on the prelp mutant hearts revealed downregulation of ECM organization and ECM-Receptor interaction processes in the mutants. Gene Ontology analysis on prelp mutants hearts transcriptome revealed increased MAPK signaling. Interestingly, genes related to degradation of cardiac HA and maturation of cardiac jelly were downregulated, and genes related to epithelial identity of cardiomyocytes were upregulated. Analysis of the mutant hearts at single cell resolution revealed increased number of mutants exhibiting rounded up cardiomyocytes and loss of apical Podocalyxin. Truncated forms of prelp were generated to identify domain specific roles for Prelp, and reintroduction of N-terminal truncated Prelp into the mutants rescued the basal lamina localization and cardiac jelly volume phenotypes. Myocardium specific re-establishment of prelp expression revealed a marked rescue of the mutant cardiovascular phenotype suggesting that tissue specific expression of prelp is not required so long as Prelp is secreted into the CJ. With these data, I’ve elucidated the role of ECM SLRPs in modulation of cardiac chamber morphogenesis process and regeneration of the heart.
• Zellen in den frühen Entwicklungsstadien eines Organismus weisen Pluripotenz auf, und im Laufe der Entwicklung des Organismus beginnen diese Zellen, sich zu differenzieren und zu wandern. Die Differenzierung ermöglicht es den Zellen, spezifische Funktionen zu entwickeln, die von den Geweben benötigt werden, und die Migration sorgt dafür, dass sich diese Zellen zum richtigen Entwicklungszeitpunkt an der richtigen Stelle befinden. Diese Prozesse sind für die Gesamtentwicklung eines mehrzelligen Organismus von entscheidender Bedeutung. Die verschiedenen Keimblätter wandern über einen Gradienten von Genexpressionslandschaften. Es hat sich gezeigt, dass die Zell-Zell-Interaktion auf verschiedene Weise erfolgt, z. B. durch autokrine, parakrine oder juxtakrine Signalübertragung, um die Zellmigration zu erleichtern. Diese Signalinteraktionen zwischen Zellen in verschiedenen Schichten erfordern Interaktionen über eine extrazelluläre Region, die als extrazelluläre Matrix (ECM) bekannt ist. Zell-ECM-Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung der Form des Embryos während der frühen morphogenetischen Ereignisse. Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese Zell-ECM-Interaktionen und der anschließende gezielte Abbau der ECM verschiedene Signalwege modulieren und zur Steuerung der gerichteten Migration des embryonalen Ektoderms beitragen können (Dzamba & DeSimone, 2018; Jayadev & Sherwood, 2017; Kyprianou et al., 2020; Wu et al., 2016). Der Schlüsselfaktor für diese Prozesse ist das Vorhandensein einer spezialisierten ECM, der sogenannten Basalmembran (BM), die sich in reifem Gewebe an der Basalseite der Epithelzelle befindet und diese von der darunter liegenden Bindegewebsschicht trennt (Rozario & DeSimone, 2010). Die Entwicklung des Herzens erfordert eine ähnliche Interaktion zwischen den Vorläuferzellen der Kardiomyozyten und der ECM. Eine optimale Entwicklung des kardiovaskulären Systems ist für mehrzellige Organismen, insbesondere für Organismen höherer Ordnung wie Wirbeltiere, entscheidend. Herzvorläufer in Wirbeltieren wie dem Zebrafisch wandern nach der Differenzierung aus dem Epiblast über eine Schicht extrazellulärer Basalmembran zur Mittellinie (Bakkers, 2011; Rosenthal & Harvey, 2010). Diese Vorläufer bilden eine Herzscheibe an der Mittellinie, die sich zum linearen Herzschlauch ausdehnt. Es hat sich gezeigt, dass extrazelluläre Basalmembranproteine wie Fibronectin diese sehr frühen Migrationsprozesse der Kardiomyozytenvorläufer modulieren (Trinh & Stainier, 2004). In der weiteren Entwicklung des Herzens besteht die lineare Herzröhre aus Herzmuskelzellen mit einer inneren Endokardzellauskleidung, die durch eine Schicht aus einer dicken geleeartigen Substanz, dem so genannten "Cardiac Jelly" (CJ), getrennt ist. Es hat sich gezeigt, dass die CJ, die auch als kardiale Basalmembran bezeichnet wird, verschiedene Entwicklungsereignisse während der Kardiogenese reguliert. Diese frühe CJ enthält Komponenten der Basallamina wie Laminine, Fibronektin, Hyaluronan sowie Kollagene wie Kollagen IV (Little et al., 1989). In dieser Studie wollte ich relativ unbekannte Gene der kardialen Basalmembran identifizieren, um die Mechanismen und die Rolle von bisher unbeschriebenen ECM-Molekülen bei der Modulation der Herzentwicklung zu verstehen. Außerdem wollte ich prüfen, ob diese aus Entwicklungsdatensätzen identifizierten Gene auch im erwachsenen Herzen exprimiert werden und zu Prozessen wie der Herzregeneration beitragen, wobei ich den Zebrafisch als Modellsystem verwendete. Anhand verschiedener Datensätze identifizierte ich Gene, die zum Zebrafisch-Matrisom gehören und die während der Herzentwicklung exprimiert werden, und verglich sie mit Regenerationsdatensätzen. Ich erstellte eine Liste von ECM-Genen, die für die Mutagenese und das anschließende phänotypische Screening und die Analyse in Frage kommen (agrn, dcn, bmp3, prelp). Ich führte eine CRISPR/Cas9 sgRNA-vermittelte Mutagenese an diesen Genen durch, die auf verschiedene Loci abzielte. Die daraus resultierenden Mutanten wurden auf potenzielle kardiovaskuläre Entwicklungsphänotypen untersucht. Darüber hinaus beschaffte ich auch veröffentlichte Mutanten für agrn, die keine offensichtlichen Entwicklungsphänotypen aufwiesen, um sie für Studien zur Herzregeneration bis zum Erwachsenenalter aufzuziehen. Mit diesen Mutanten wollte ich einzigartige und unterschiedliche Rollen für diese ECMGene bei der Entwicklung und Regeneration des Zebrafischherzens identifizieren und aufklären. Agrin-Mutanten, die auf die Dystroglykan-Bindungsdomäne abzielen, wiesen während der Herzentwicklung keine offensichtlichen groben morphologischen Defekte auf und waren im adulten Stadium lebensfähig. Diese Mutanten wurden bis zum Erwachsenenalter aufgezogen und kryo-verletzt. Die Herzen der Mutanten wiesen eine verringerte Proliferation der Kardiomyozyten auf, aber keinen signifikanten Unterschied in der Dedifferenzierung der Kardiomyozyten, was auf eine mögliche Rolle bei Prozessen hindeutet, die sich von dem durch Agrin modulierten Prozess der Herzregeneration bei Mäusen unterscheiden (Bassat et al., 2017).