Open Access

LaShae Nicholson

• Brain development is a complex and highly organized process that relies on the coordinated interaction between neurons and vessels. These cell systems form a neurovascular link that involves the exchange of oxygen, ions, and other physiological components necessary for proper neuronal and vascular function. This physiologically coupled process is executed through analogous structural and molecular signaling mechanisms shared by both cell types. At the neurovascular interface, the cellular crosstalk via these shared signaling mechanisms allows for the synchronized expansion and integration of neurons and vessels into complex cellular networks. This study investigated the role of VEGFR2, a receptor for vascular endothelial growth factor (VEGF), during postnatal neuronal development in the mouse hippocampus. Prior studies have revealed physiological roles of VEGF, a pro-angiogenic morphogen, in nervous system development. However, it was unclear if VEGF signaling had a direct effect on neuronal physiology and function through neuronal-expressing receptors. In this investigative work, we identified a previously unknown function of VEGFR2, whereby VEGF-induced signaling coordinates the development and circuitry integration of CA3 pyramidal neurons in the early postnatal mouse hippocampus. Mechanistically, we found that VEGFR2 signaling requires receptor endocytosis, a process mediated by ephrinB2. We also found that VEGF-induced cooperative signaling between VEGFR2 and ephrinB2 is functionally required for the dendritic arborization and spine maturation of developing CA3 neurons during the first few postnatal weeks. Moreover, in a collaborative effort with the research group of Carmen Ruiz de Almodovar, formerly at the University of Heidelberg, we simultaneously studied VEGF-induced VEGFR2 signaling in CA3 axonal development. Together, we aimed to gain a comprehensive understanding of the complex interplay between VEGF and VEGFR2 signaling during the early postnatal development of CA3 neurons. Ruiz de Almodovar’s research group found that, unlike the branch and spine development of CA3 dendrites, VEGF-VEGFR2 signaling promotes axonal development through mechanisms that are independent of ephrinB2 function. Our findings on CA3 dendritic development are reported in the published manuscript, Harde et al. (2019), and the complementary work on CA3 axonal development from Ruiz de Almodovar's group is presented in the co-published manuscript, Luck et al. (2019). Although the totality of Ruiz de Almodovar's group's work on CA3 axons is not fully discussed here, it is referenced where noted to provide biological context for our findings on CA3 dendritic development. VEGFR2 signaling within neurovascular niches is known to play a role in the neurogenesis of neural progenitor cells during embryonic development and within the adult brain. However, the precise localization of neuronal VEGFR2 expression and functional role within the nervous system during postnatal brain development was unknown. To investigate this, we used immunohistochemistry to identify the spatial expression of VEGFR2 within the mouse hippocampus during the first few weeks after birth. Our results showed that VEGFR2 was predominantly expressed within the hippocampal vasculature, consistent with prior studies. However, we also observed localized VEGFR2 expression in pyramidal cell neurons of the hippocampal CA3 region by postnatal day 10 (P10). This spatially restricted postnatal expression of VEGFR2 in CA3 neurons suggested a potential role in the development of these neurons during this developmental stage. The first two weeks after birth in the mouse hippocampus is a critical period for the development of neuronal circuits, as neurons undergo extensive dendritic arborization and spine formation. To explore the role of VEGFR2 in the postnatal nervous system, we used a Nes-cre VEGFR2lox/- mouse line to target the deletion of VEGFR2 expression within the nervous system while preserving normal receptor expression in all other cell types. We also generated corresponding control mice that were negative for Nes-cre. By breeding these mice with Thy1-GFP reporter mice, we could analyze the functional consequences of VEGFR2 by assessing the morphologies of CA3 dendritic trees and spine density and maturation at P10 and P15, respectively. Our analysis showed that CA3 neurons in Nes-cre VEGFR2lox/- mice had less complex dendritic arbors compared to control mice. There were significant reductions in total length and branch points, particularly in areas located 100-250 μm from the cell soma within the stratum radiatum layer. Additionally, Nes-cre VEGFR2lox/- mice exhibited a significant decrease in spine density accompanied by an increased proportion of immature spines. These findings suggest that VEGFR2 plays a crucial role in the proper development of CA3 dendrites and spines during the early postnatal weeks.
• Die Entwicklung des Gehirns ist ein komplexer und hochorganisierter Prozess, der auf einer koordinierten Interaktion von Neuronen und Gefäßen beruht. Diese Zellsysteme bilden eine neurovaskuläre Verbindung, die den Austausch von Sauerstoff, Ionen und anderen physiologischen Komponenten ermöglicht, die für eine reguläre neuronale und vaskuläre Funktion notwendig sind. Dieser physiologisch aneinander gekoppelte Prozess wird durch analoge, strukturelle und molekulare Signalmechanismen gesteuert, die beiden Zelltypen gemeinsam sind. An der neurovaskulären Schnittstelle ermöglicht der zelluläre Austausch über diese gemeinsamen Signalmechanismen die synchronisierte Expansion und Integration von Neuronen und Gefäßen in komplexe zelluläre Netzwerke. Die hier durchgeführte Studie untersuchte die Rolle von VEGFR2, einem Rezeptor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), während der postnatalen neuronalen Entwicklung im Hippocampus der Maus. Frühere Studien haben physiologischer Rollen von VEGF, einem proangiogenen Morphogen, bei der Entwicklung des Nervensystems untersucht. Es war jedoch bisher nicht bekannt, ob die VEGF-Signalübertragung über neuronale exprimierende Rezeptoren einen direkten Einfluss auf die neuronale Physiologie und Funktion hat. In dieser Dissertation habe ich die VEGF-induzierte Signalübertragung identifiziert, die die Entwicklung und Integration von CA3-Pyramidenneuronen im frühen postnatalen Hippocampus der Maus koordiniert - eine bisher unbekannte Funktion von VEGFR2. Weiterhin habe ich auf dem mechanistischen Level gezeigt, dass die VEGFR2-basierte Signalübertragung eine Rezeptorendozytose erfordert, was einen durch ephrinB2 vermittelten Prozess darstellt. Ich fand zudem heraus, dass die VEGF-induzierte kooperative Signalübertragung zwischen VEGFR2 und ephrinB2 funktionell für die dendritische Verzweigung und Reifung dendritischer Dornenfortsätze sich entwickelnder CA3-Neuronen während der ersten Wochen nach der Geburt erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Carmen Ruiz de Almodovar, ehemals an der Universität Heidelberg, die VEGF-induzierte VEGFR2-Signalübertragung in der axonalen Entwicklung von CA3 untersucht. Das Ziel dieser Kooperation war, gemeinsam ein umfassendes Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen VEGF- und VEGFR2-Signalen während der frühen postnatalen Entwicklung von CA3-Neuronen zu erreichen. Die Arbeitsgruppe von Ruiz de Almodovar fand dabei heraus, dass die VEGF-VEGFR2-Signalübertragung im Gegensatz zur Entwicklung von dendritischer Verzweigung und der Entwicklung der Dornenfortsätze von CA3-Dendriten, die axonale Entwicklung durch Mechanismen fördert, die von der ephrinB2-Funktion unabhängig sind. Unsere Ergebnisse zur CA3-Dendritenentwicklung (Harde et al., 2019), sowie die ergänzende Arbeit von Ruiz de Almodovars Arbeitsgruppe zur axonalen Entwicklung von CA3 (Luck et al., 2019), wurden mittlerweile beide veröffentlicht. Obwohl die Gesamtheit der Arbeiten von Ruiz de Almodovars Gruppe zu CA3-Axonen hier nicht vollständig diskutiert wird, wird an den entsprechenden Stellen darauf verwiesen, um den biologischen Kontext für unsere Ergebnisse zur dendritischen CA3-Entwicklung darzulegen. Während der Embryonalentwicklung spielt die VEGFR2-gesteuerte Signalübertragung in neurovaskulären Nischen eine wichtige Rolle für die Neurogenese neuronaler Vorläuferzellen. Eine ähnliche Rolle wird diesem Mechanismus auch im erwachsenen Gehirn zugeschrieben. Die genaue Lokalisierung neuronaler VEGFR2-Expression, sowie deren funktionelle Bedeutung im Nervensystem während der postnatalen Gehirnentwicklung, war jedoch bisher unbekannt. Um diese Rolle näher zu untersuchen, verwendete ich Methoden der Immunhistochemie, dies im Spezifischen um die räumliche Expression von VEGFR2 im Hippocampus der Maus in den ersten Wochen nach der Geburt zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass VEGFR2 überwiegend im Gefäßsystem des Hippocampus exprimiert, was mit früheren Studien übereinstimmt. Ich beobachtete jedoch auch eine lokalisierte VEGFR2-Expression in Pyramidenzellen der Hippocampus-CA3-Region am postnatalen Tag 10 (P10). Diese lokalisierte postnatale Expression von VEGFR2 in CA3-Neuronen zwischen P1 und P10 deutet auf eine mögliche Rolle dieses Rezeptors bei der Entwicklung dieser Neuronen in diesem Entwicklungsstadium hin.