Membrantopologie und funktionale Charakterisierung der Transmembrandomänen des Transportkomplexes TAP

  • Der humane ABC-Transporter TAP (transporter associated with antigen processing) spielt in der Antigenprozessierung und in der MHC Klasse I-vermittelten Antigenpräsentation eine zentrale Rolle. Unter ATP-Hydrolyse katalysiert der heterodimere TAP-Komplex den Transport von proteosomal degradierten Peptiden aus dem Cytosol in das ER-Lumen. Diese werden im Peptidbeladungskomplex (PLC) auf MHC Klasse I-Moleküle geladen und zur Zelloberfläche transportiert, wo sie zytotoxischen T-Zellen präsentiert werden. Die Assemblierung eines funktionalen Komplexes hängt dabei von der korrekten intra- und intermolekularen Anordnung seiner Transmembransegmente (TMS) ab. Die strukturelle Organisation des TAP-Komplexes ist schon seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschung und wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Cystein-freie Proteinvarianten dienen bei der Untersuchung der Topologie als sehr gute Hilfsmittel und wurden bereits erfolgreich zur Aufklärung der Membrantopologie von komplexen Membranproteinen, wie P-glycoprotein oder der Lactose-Permease LacY, eingesetzt (Kaback et al., 2001; Loo und Clarke, 1995). Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden humane TAP1- und TAP2-defiziente Fibroblasten, die ansonsten alle anderen Komponenten der Antigenpräsentationsmaschinerie besitzen, stabil mit der jeweiligen humanen Cystein-freien TAP1- oder TAP2-Untereinheiten transfiziert. Alle 19 natürlichen Cysteine von TAP1 und TAP2 konnten vorher durch de novo Gensynthese ausgetauscht werden. Nach erfolgreicher Expression konnte ein ATP-abhängiger Peptidtransport, der spezifisch durch den viralen Inhibitor ICP47 inhibiert wurde, nachgewiesen werden. Außerdem konnte die MHC Klasse I-Oberflächenexpression der Zellen, ein Indikator einer funktionsfähigen Antigenpräsentierung, nach Transfektion mit den Cystein-freien TAP-Untereinheiten wiederhergestellt werden. Im zweiten Abschnitt wurde die Membrantopologie des humane TAP-Transporters in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex durch ortsspezifische Mutagenese in Kombination mit der Markierung mittels thiolspezifischer Fluorophore untersucht. Durch Co-Immunpräzipitationen und Transportstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte die Funktionalität des, in Sf9 Zellen exprimierten, Cystein-freien TAP-Komplexes gezeigt werden. Einzelne Cysteine wurden aufgrund von Hydrophobizitätsanalysen in Kombination mit Sequenzvergleichen von anderen ABC-Transportern in vorhergesagte cytosolische oder ER-luminale Schleifen der TAP1-Untereinheit eingeführt und deren Zugänglichkeit mit dem thiolspezifischen, membran-impermeablen Fluorophor Fluoreszein-5-Maleimid in semi-permeabilisierten Zellen untersucht. Es konnte zum ersten Mal experimentell gezeigt werden, dass die Transmembrandomäne (TMD) der TAP1-Untereinheit in einem funktionalen Komplex aus zehn Transmembranhelices aufgebaut ist. Die TMD lässt sich in eine für die Heterodimerisierung, die Peptidbindung und den Transport essentielle und für viele ABC-Transporter charakteristische Core-Domäne, und zusätzliche N-terminale Domänen, die für die Bindung von Tapasin und die Assemblierung des PLCs verantwortlich sind, unterteilen. Somit konnte experimentell die Membrantopologie des ABC-Transporters TAP in einem funktionalen Peptidbeladungskomplex aufgeklärt werden. Der dritte Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der veränderten Peptidbeladungskapazität, die in Kombinationen aus wildtyp TAP1 und Cystein-freiem TAP2 beobachtet wurde. Durch ortsspezifische Mutagenese wurden einzelne Cysteine in TAP2 wiedereingeführt und deren Funktionalität in Transportstudien analysiert. Es konnte ein einzelnes Cystein in TAP2 identifiziert werden, welches die Peptidbeladungskapazität beeinflusst und durch Modifikation mit thiolspezifischen Reagenzien zum Schalter für die Peptidbindung wird. Durch Quervernetzungsstudien mit radioaktiv-markierten Peptiden konnte weiterhin ein direkter Kontakt zwischen dem Cystein und dem gebundenen und somit transportierten Peptid des TAP-Transporters nachgewiesen werden.
  • The transporter associated with antigen processing (TAP) translocates antigenic peptides from the cytosol into the ER-lumen for subsequent loading onto MHC class I molecules. These peptide/MHC complexes are recognized at the cell surface by cytotoxic T-lymphocytes. Assembly of the functional peptide transport and loading complex depends on intra- and intermolecular packing of transmembrane helices (TMs). As a central tool to investigate the structure and function of the TAP complex, cysteine-less human TAP subunits were created by de novo gene synthesis, replacing all 19 cysteines in TAP1 and TAP2 by other amino acids. After expression in TAP-deficient human fibroblasts, cysteine-less TAP1 and TAP2 are functional with respect to ATP-dependent peptide transport and sensitivity to the TAP-specific inhibitor ICP47 from herpes simplex virus. Cysteine-less TAP1 and TAP2 restore maturation and intracellular trafficking of MHC class I molecules to the cell surface. In the second part of the thesis the membrane topology of human TAP1 within an assembled and functional transport complex was examined by cysteine-scanning mutagenesis. The accessibility of single cysteine residues facing the cytosol or ER-lumen was probed by a minimal invasive approach using membrane-impermeable, thiol-specific fluorophors in semi-permeabilized “living” cells. TAP1 contains ten transmembrane segments placing the N- and C-terminus in the cytosol. The transmembrane domain consists of a translocation core of six TMs, a building block conserved among most ABC-transporters, and a unique N-terminal domain of four TMs, essential for tapasin binding and assembly of the peptide-loading complex. This study provides a first map on the structural organization of the functional TAP complex. In the last part, the peptide binding capacity of constructs with wild-typ TAP1 and Cysteine-less TAP2 was investigated. Based on Cysteine-less TAP1 and TAP2 a set of single-cysteine constructs of TAP2 were generated and one Cysteine was identified to be involved in the alteration of the peptide binding ability. The Cysteine at position 213 could restore the peptide binding capacity. Different thiol-specific reagents to modify the single Cysteine of the construct S213C could inhibit peptide binding. Furthermore crosslinking experiments revealed a direct interaction of the peptide and the Cysteine 213.

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Metadaten
Author:Susanne Schrodt
URN:urn:nbn:de:hebis:30-24268
Referee:Robert TampéORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/02/08
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2005/12/06
Release Date:2006/02/08
Tag:Antigenprozessierung; Cystein-Scanning Mutagenese; Membrantopologie; TAP Transporter
GND Keyword:ABC-Transporter
HeBIS-PPN:135824028
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht