Open Access

Christian Schölz

• The adaptive immune system of jawed vertebrates is based on recognition and elimination of cells that are either invaded by intracellular pathogens or malignantly transformed. One essential component of these processes is the cell surface presentation of antigenic peptides via major histocompatibility complex (MHC) class I molecules to cytotoxic T-cells (CTLs). Cells degrade defective ribosomal products and misfolded or unwanted proteins by the ubiquitin-proteasome pathway. The resulting degradation products are recognized and translocated by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the endoplasmic reticulum (ER) lumen, where they are loaded onto MHC I molecules. Assembled peptide-MHC complexes are then shuttled by the secretory pathway to the cell surface for antigen presentation to CTLs, leading in the case of viral infection or malignant transformation to lysis and apoptosis of the target cell. Due to the fact that the TAP complex represents a key control point within the antigen presentation pathway, several viruses have evolved sophisticated strategies to evade immune surveillance by interfering with TAP function. Detailed studies of the TAP mechanism or its viral inhibition have been severely impeded by difficulties in expressing sufficient amounts of functional heterodimeric TAP complex. Thus, the overexpression of TAP in the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established for functional analysis of this important ABC complex. Biomass production was scaled up by fermentation using classical batch and feed methods. Extensive screening of optimal solubilization and purification conditions allowed the isolation of the heterodimeric transport complex. Notably, only the very mild detergent digitonin preserved TAP function. Hereby, the optimal solubilization and purification strategy yielded in 30 mg TAP transporter per liter culture. Remarkably, the protein amount was 50-fold increased compared to previously described expression/purification in cultured insect cells. The high yield and quality of TAP produced in P. pastoris allowed an extensive analysis of substrate binding and transport kinetics of the transport complex in the membrane, its solubilized and purified state, as well as the reconstituted state. Thereby, a strong and direct effect of the lipid bilayer on ATP hydrolysis and peptide transport was discovered. These important results were extended further by successful functional reconstitution of the antigen translocation machinery in different lipid environments. For the first time, a stimulation of the transport activity by phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylethanolamine (PE) was observed, whereas cholesterol was identified as an inhibitor of TAP activity. Purification of TAP and subsequent thin-layer chromatography (TLC)/liquid chromatography Fourier transform-mass spectrometry (LC FT-MS) fingerprinting of residual lipids exhibited specifically associated glycerophospholipids; mainly PC, PE, and PI species. Strikingly, these lipids not only represent the primary class of phospholipids of the ER but were also shown to be essential for functional reactivation of delipidated, and thus inactive, TAP. The results demonstrate that transport of antigenic peptides by the ABC transporter TAP strictly requires specific glycerophospholipids. In addition to the biochemical characterization of heterologous produced TAP, the soluble domain of the viral inhibitor US6 from human cytomegalovirus was expressed in E. coli. Optimization of the purification and refolding strategy yielded in functional protein, with a 35-fold increased protein amount compared to previous purification procedures. Protein activity was analyzed by specific inhibition of ATP binding to TAP. Furthermore, high protein yields allowed detailed investigation of TAP-dependent spatial and mechanistic separation of MHC I restricted cross-presentation in professional antigen presenting cells (pAPC).
• Das adaptive Immunsystem von Vertebraten basiert auf klonaler Selektion und Expansion von Lymphozyten und der damit einhergehenden Erkennung und Eliminierung von Pathogen-infizierten oder maligen transformierten Zellen. Hierbei spielt insbesondere die Oberflächenpräsentation von antigenen Peptiden durch Haupthistokompatibilitäts-komplexe (MHC) der Klasse I eine große Rolle. In der Zelle werden fehlgefaltete, denaturierte oder unvollständig translatierte Proteine durch Chaperon-vermittelte Ubiquitinierung dem proteasomalen Abbau zugeführt. Etwa 1% der resultierenden Degradationsprodukte werden von dem ATP-binding cassette (ABC) Transporter TAP (transporter associated with antigen processing) erkannt und in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert, wo sie mit Hilfe des makromolekularen peptide-loading complex (PLC) auf MHC I Moleküle übertragen werden. Assemblierte Peptid-MHC I Komplexe gelangen anschließend über den konstitutiven, sekretorischen Weg auf die Zelloberfläche, wo sie von zytotoxischen T Lymphozyten (CTLs) inspiziert werden. Die Präsentation zellfremder Proteinfragmente wie z.B. viraler Degradationsprodukte löst dabei die CTL-vermittelte Lyse bzw. Apoptose der betreffenden Zelle aus (zellvermittelte Zytotoxizität). Da TAP eine essentielle Funktion bei der MHC I vermittelten Antigenpräsentation ausübt, stellt das ABC-Protein ein direktes Ziel für verschiedenste virale Inhibitoren dar. Diese verhindern durch Interaktion mit TAP die Peptidtranslokation, wodurch es den Viren ermöglicht wird, der Erkennung durch das Immunsystem zu entgehen. TAP gehört zur großen Familie der ABC Transporter, die die Bindung und darauffolgende Hydrolyse von ATP mit dem Transport von Substraten entgegen eines Konzentrationsgradienten koppeln. Bisher wurden 48 humane ABC Transporter identifiziert, welche ausschließlich als Exportsysteme fungieren. Das Substratspektrum reicht dabei von Lipiden und Steroiden (ABCG1, ABCG5/8) über Ionen (CFTR) bis hin zu immunogenen Peptiden (TAP). Mutationen in ABC Transportern korrelieren mit einer Reihe von Krankheiten, wie z.B. Hypercholesterinämie, zystischer Fibrose oder Diabetes Mellitus. Eine besondere medizinische Relevanz kommt den multidrug resistance (MDR) Proteinen wie P-glycoprotein, MRP1 und BCRP zu, welche die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika vermitteln. ABC-Transporter weisen eine typische Architektur aus insgesamt vier Domänen auf: Zwei in die Membran eingebettete Transmembrandomänen (TMDs), welche die Translokationspore formen, sowie zwei Nukleotidbindedomänen (NBDs), welche ATP binden und für dessen Hydrolyse verantwortlich sind. Charakteristisch für Proteine der ABC-Superfamilie sind die hoch konservierten Sequenzmotive innerhalb der NBDs. Hierbei handelt es sich um die in der katalytischen Kerndomäne liegenden Walker A- (P Loop; Konsensussequenz: GXXGXK(S/T)) und Walker B-Motive (Konsensussequenz: ooooD; wobei o hydrophobe Aminosäuren kennzeichnet), sowie den sogenannten Q Loop und das H-Switch Motiv. Innerhalb der zweiten, helikalen Domäne, welche strukturell eine höhere Diversität aufweist, befindet sich das ABC-Signature Motiv, auch C Loop (Sequenzfolge: LSGGQ) genannt. Die relative Anordnung der katalytischen und helikalen Domäne ist dabei vom Bindungszustand des Nukleotids abhängig. Die Bindung von ATP bewirkt eine Dimerisierung der beiden NBDs in einer head-to-tail Orientierung, wobei das Nukleotid zwischen dem P Loop der einen und dem C-Loop der gegenüberliegenden Untereinheit eingeschlossen wird. Im Gegensatz zu den NBDs weisen die TMDs eine deutlich höhere Sequenzvariabilität auf, welche vermutlich der hohen Substratdiversität Rechnung trägt. Die TMDs von ABC-Exportproteinen bestehen generell aus 12 Transmembranhelices (TMHs), wobei jeweils sechs TMHs einer Untereinheit zuzuordnen sind. Der funktionale TAP Komplex, bestehend aus den zwei Halbtransportern TAP1 (ABCB2) und TAP2 (ABCB3), bildet hierbei eine Ausnahme, indem er jeweils 4 zusätzliche TMHs aufweist. Während die sechs C terminalen Helices für die Bindung des Peptids, sowie dessen Transmembranbewegung verantwortlich sind, bilden die vier N-terminalen TMHs eine Plattform zur Bindung von Tapasin, einem Faktor des PLC. Die NBDs des heterodimeren TAP-Komplexes, welche für die Bindung und Hydrolyse von ATP benötigt werden, weisen einige Unterschiede zu den klassischen Konsensusmotiven auf: Das katalytisch aktive Glutamat ist in TAP1 durch Aspartat und das konservierte Histidin durch Glutamin ersetzt. Zusätzlich sind in TAP2 Serin und Glycin des C-Loops durch Alanin ausgetauscht, wodurch der TAP Komplex eine Konsensus-, sowie eine degenerierte ATPase-Seite besitzt. Röntgenstrukturanalysen der TAP1-NBD als auch biochemische Daten suggerieren eine wesentliche Rolle der Konsensusseite für die ATPase Reaktion, während für die degenerierte Seite eine regulatorische Funktion vorgeschlagen wird. Ein detailliertes Verständnis des TAP abhängigen ATP-Hydrolyse Zyklus sowie dessen Kopplung mit der Substrattranslokation fehlt bis dato. Allerdings lassen die Ähnlichkeiten aller bisher aufgeklärten ABC-Proteinstrukturen einen generellen Transportmechanismus für ABC-Exporter vermuten. Hierbei sind eine Reihe von Nukleotid- und Substrat-abhängigen konformationellen Änderungen notwendig, um den Transport des jeweiligen Substrates über die Membran zu bewerkstelligen. Basierend auf dem „alternating access“ Modell führt die Bindung von ATP zur Umwandlung der nach innen gerichteten Konformation hin zur nach außen zugewandten Transporterstruktur und damit einhergehend zur Substrattranslokation. Die Hydrolyse des Triphosphatnukleotids und die anschließende Freilassung von ADP und Pi bewirken das Zurückkehren des Exporters in seinen Ursprungszustand. Um einen vektoriell gerichteten Transport zu gewährleisten, geht man dabei von einer höheren Substrataffinität in der nach innen gerichteten gegenüber der nach außen gerichteten Struktur sowie einer Substrat stimulierten ATP-Hydrolyse-Reaktion aus. Für TAP konnte gezeigt werden, dass die Peptid- und ATP-Bindung unabhängig voneinander stattfinden, wobei die Hydrolyse des gebundenen ATPs Peptid-stimuliert ist. Vor kurzem wurde innerhalb der Transmissionsschnittstelle zwischen TMD und NBD eine Sensorregion identifiziert, die für die allosterische Kopplung der Peptid-Bindung und anschließender ATP-Hydrolyse verantwortlich zu sein scheint. Quervernetzung des Peptidsensors innerhalb des zytosolischen Loops (CL) 1 bzw. der Peptid-Bindungsregion (CL2) mit dem sogenannten X-Loop der gegenüberliegenden NBD resultierte dabei entweder in einem Arrest des Transporters in einem Peptid-Transport-inkompetenten Zustand oder aber in einer Inhibition der Substrat-Bindung. Weiterführende, funktionale Analysen des ABC-Transporterkomplexes TAP waren aufgrund der geringen Proteinmengen in den bisher verwendeten Expressionssystemen (humane B-Lymphozyten, Insektenzellen, Bäckerhefe) nicht möglich. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit die heterologe Überexpression des heterodimeren Transporters in Pichia pastoris etabliert. Diese methylotrophe Hefe wurde zur erfolgreichen Expression verschiedener Säuger-Membranproteine, wie z.B. des spannungsabhängigen Kaliumkanals (Kv1.2), P Glycoprotein (ABCB1A) oder des Steroltransporter-Komplexes ABCG5/8 verwendet. Da die Expression von nicht-Hefe-eigenen Proteinen auf Grund seltener Codons oft erschwert ist, wurde die Gensequenz für beide Halbtransporter entsprechend optimiert. Hierbei führte die Kombination des Wildtyp-TAP2 Proteins zusammen mit der optimierten Version von TAP1 zur gewünschten Überexpression. Da das Pichia-Expressionssystem hauptsächlich auf einer erhöhten Biomasse-Produktion als auf einer direkten Überexpression beruht, war eine Optimierung der Wachstumsbedingungen essentiell. Durch Fermentation unter strikter Kontrolle diverser Wachstumsparameter, wie z.B. Sauerstoffgehalt, Methanolkonzentration und pH-Wert, konnte die Zelldichte um ein Vielfaches gegenüber der Expression in Schüttelkultur erhöht werden. Das Nassgewicht der geernteten Zellen betrug auf diese Weise etwa 250 g pro Liter Kultur. Die Funktionalität von heterolog exprimiertem TAP konnte durch Peptidtransportstudien bestätigt werden. Die Michaeliskonstanten von 0,34 ± 0,12 µM (Km, Peptid) und 96 ± 41 µM (Km, ATP) sind konsistent mit den Daten aus anderen etablierten Expressionssystemen. Umfangreiche Solubilisations- und Reinigungsstudien erlaubten die Isolierung des heterodimeren ABC-Transporters in hoher Menge und Reinheit. Allerdings führten mit Ausnahme von Digitonin alle getesteten Detergenzien zu einem oft vollständigen Verlust der Peptid-Bindungsaktivität, was vermutlich auf eine Delipidierung des Transportkomplexes zurückzuführen ist. Die Solubilisation und Reinigung mittels des sehr milden Detergenz Digitonin hingegen ließ die Isolation von bis zu 30 mg monodispersen TAP Komplexes pro Liter Kultur zu. Derartig gereinigtes TAP war funktional hinsichtlich der Peptid- und ATP-Bindung, vergleichbar mit TAP aus Insektenzellen. Interessanterweise konnte im gereinigten Zustand eine signifikante Erhöhung der Michaeliskonstanten gegenüber den zuvor ermittelten Werten in der Zellmembran beobachtet werden. Es ist davon auszugehen, dass dieser Effekt auf einer veränderten Lipidumgebung bzw. einem geänderten lateralen Membrandruck beruht, welcher die Stabilität und Konformation von Proteinen nachweislich beeinflusst. Ein Einfluss der Membranumgebung auf die Enzymkinetik konnte durch Rekonstitution des isolierten TAP Komplexes in E. coli Liposomen belegt werden, da ähnliche Michaeliskonstanten wie in der Zellmembran gemessen wurden. Ein direkter Effekt der Lipidumgebung auf die TAP Aktivität wurde in nachfolgenden Experimenten durch Rekonstitution in verschiedene Lipidgemische analysiert und verifiziert. Hierbei konnte eine Modulation des Peptidtransports durch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylethanolamin (PE) beobachtet werden. Da keine Stimulation durch Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylglycerin (PG) verzeichnet werden konnte, ist von einer spezifischen, kopfgruppenabhängigen Interaktion und nicht von einem ladungsabhängigen Effekt auszugehen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass das Sterol Cholesterin die TAP-Aktivität negativ beeinflusst. Mittels saurer Hydrolyse und Dünnschichtchromatographie wurde die beobachtete Lipidabhängigkeit detailliert charakterisiert. Dabei konnten nach Reinigung des TAP Komplexes assozierte Lipide nachgewiesen werden, deren Identität mit Hilfe von Flüssigkeitschromatographie Fourier Transform-Massenspektrometrie (LC FT-MS) eindeutig bestimmt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass der TAP Komplex mit nichtgesättigte Varianten von PI, PC sowie geringeren Mengen PE Lipiden assoziert ist, was im Einklang mit dem hohen Anteil ungesättigter Lipidspezies im ER steht. Ferner konnte gezeigt werden, dass die nahezu vollständige Delipidierung des Transportkomplexes durch DDM direkt mit einem Aktivitätsverlust einhergeht. Durch Rekonstitution von delipidiertem TAP in die zuvor nachgewiesenen assoziierten Glycerophospholipide konnte eine Reaktivierung der Peptid-Bindung erzielt werden. Auf diese Weise konnte zum ersten Mal eine spezifische Lipidabhängigkeit des TAP-basierten Peptid-Transports beobachtet und biochemisch analysiert werden. Die Daten zeigen, dass die Translokation von antigenen Peptiden nicht nur substratabhängig ist, sondern auch einer spezifischen Modulation durch Lipide unterworfen ist. Neben der biochemischen Charakterisierung von TAP, wurde die lösliche Domäne des viralen TAP-Inhibitors US6 aus dem humanen Cytomegalievirus heterolog in E. coli exprimiert. Im Anschluß wurde die Reinigung und Rückfaltung des Proteins maßgeblich optimiert, was in einer etwa 35-fachen Erhöhung der Proteinausbeute gegenüber den im herkömmlichen Verfahren isolierten Mengen resultierte. Der virale Faktor war funktional und zeigte eine spezifische Inhibition der ATP-Bindung des TAP-Komplexes. Weiterhin wurden durch die hohen Proteinausbeuten von US6 detaillierte Untersuchungen der TAP-abhängigen Kreuzpräsentation in professionel Antigen präsentierenden Zellen ermöglicht. Hierbei zeigte sich, dass sich diese räumlich wie auch mechanistisch deutlich von der klassischen, endogenen Antigenpräsentation unterscheidet.