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Andreas T. Meßmer

• Detailed knowledge of reaction mechanisms is key to understanding chemical, biological, and biophysical processes. For many reasons, it is desirable to comprehend how a reaction proceeds and what influences the reaction rate and its products. In biophysics, reaction mechanisms provide insight into enzyme and protein function, the reason why they are so efficient, and what determines their reaction rates. They also reveal the relationship between the function of a protein and its structure and dynamics. In chemistry, reaction mechanisms are able to explain side products, solvent effects, and the stereochemistry of a product. They are also the basis for potentially optimizing reactions with respect to yield, enhancing the stereoselectivity, or for modifying reactions in order to obtain other related products. A key step to investigate reaction mechanisms is the identification and characterization of intermediates, which may be reactive, short-lived, and therefore only weakly populated. Nowadays, the structures of those can in most cases only be hypothesized based on products, side products, and isolable intermediates, because intermediates with a life time of less than a few microseconds are not accessible with the commonly used techniques for structure determination such as X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. In this thesis, two-dimensional infrared (2D-IR) spectroscopy is shown to be a powerful complement to the existing techniques for structure determination in solution. 2D-IR spectroscopy uses a femtosecond laser setup to investigate interactions between vibrations - analogous to 2D-NMR, which investigates the interactions between spins. Its ultrafast time resolution makes 2D-IR spectroscopy particularly well suited for the two topics investigated in this thesis: Structure Determination of Reactive Intermediates and Conformational Dynamics of Proteins. Structure Determination of Reactive Intermediates: The focus of this thesis is using polarization-dependent 2D-IR (P2D-IR) spectroscopy for structure determination of N-crotonyloxazolidinone (referred to as 1), a small organic compound with a chiral oxazolidinone, known as Evans auxiliary, and its reactive complexes with the Lewis acids SnCl4 and Mg(ClO4)2. Chiral oxazolidinones in combination with Lewis acids have frequently been used in stereoselective synthesis for over 30 years. Nevertheless, the detailed mechanisms are in many cases xvi ABSTRACT still mere hypotheses and have not yet been experimentally proven. By accurately measuring the angles between the transition dipole moments in the molecules using an optimized P2D-IR setup and comparing the results to DFT calculations, the conformation of 1 and the conformation and coordination of the main complexes with SnCl4 and Mg(ClO4)2 are unequivocally identified and analyzed in depth. Structural details, such as a slight twist in the solution structure of 1, are detected using P2D-IR spectroscopy; these cannot be inferred from NMR spectroscopy or DFT calculations. In addition to the main Lewis acid complexes, complexes in low concentration are detected and tentatively assigned to different conformations and complexation geometries. The knowledge of those structures is essential for rationalizing the observed stereoselectivities. Additionally, a method is introduced that enables structure determination of molecules in complex mixtures and even in the presence of molecules with similar spectral properties and in high concentration. This work sets the stage for future studies of other substrate-catalyst complexes and reaction intermediates for which the structure determination has not been possible to date. Conformational Dynamics of Proteins: Exchange 2D-IR spectroscopy allows the investigation of fast dynamics without disturbing the equilibrium of the exchanging species. It is therefore well suited to investigate fast dynamics of proteins and to reveal the speed limit of those. The temperature dependence of the conformational dynamics between the myoglobin substates A1 and A3 in equilibrium is analyzed. The various substates of myoglobin can be detected with FTIR spectroscopy, if carbon monoxide is bound to the heme. From previous studies it is known that the exchange rates at room temperature are in the picosecond time range, well suited to be investigated by 2D-IR spectroscopy. In the temperature range between 0 °C and 40 °C only a weak temperature dependence of the exchange rate in the myoglobin mutant L29I is observed in the present study. The exchange rate approximately doubles from 15 ns-1 at 0 °C to 31 ns-1 at 40 °C. It turned out that the conformational dynamics correlates linearly with the solvent viscosity, which itself is temperature dependent. Comparing our results to measurements at cryogenic temperatures, the linear relation between exchange time constant for this process and the viscosity is shown for the temperature range between -100 °C and 40 °C (corresponding to a viscosity change of 14 orders of magnitude). Thus, it is proven that the dynamics of the conformational switching are mainly determined by solvent dynamics, i.e., the protein dynamics are slaved to the solvent dynamics. This is the first time slaving is observed for such fast processes (in the picosecond time range). The observation implies a long-range structural rearrangement between the myoglobin substates A1 and A3. In addition, the exchange for other mutants and wild type myoglobin is analyzed qualitatively and found to agree with the conclusions drawn from L29I myoglobin.
• Die genaue Kenntnis der Reaktionsmechanismen ist eine wichtige Grundlage, um chemische, biochemische und biophysikalische Prozesse verstehen zu können. Es ist aus vielen Gründen erstrebenswert, den detaillierten Reaktionsverlauf zu kennen und nachvollziehen zu können, welche Faktoren die Geschwindigkeit einer Reaktion und deren Ausbeute beeinflussen und warum welche Produkte entstehen. In der Biophysik geben Reaktionsmechanismen einen Einblick in die Funktionsweise von Proteinen und erklären, wie die hohe Effizienz enzymkatalysierter Reaktionen zustande kommt. Zudem ermöglichen sie es, das Zusammenspiel zwischen Proteinstruktur, Proteindynamik und der Funktion des Proteins zu verstehen. In der Chemie werden Reaktionsmechanismen dazu genutzt, um Nebenprodukte, Lösungsmitteleffekte und die Stereochemie der Produkte zu erklären. Sie sind die Basis, um die Produkte von Reaktionen vorherzusagen und bestehende Reaktionen im Hinblick auf Ausbeute und Stereoselektivität zu optimieren. Ein entscheidender Schritt für die Aufklärung von Reaktionsmechanismen ist die Identifikation und Charakterisierung von Intermediaten. Diese sind meist sehr reaktiv, von kurzer Lebensdauer und somit nur in sehr geringen Konzentrationen in den Reaktionsmischungen vorhanden. Dies führt dazu, dass die Struktur der reaktiven Intermediate heutzutage meist nur aufgrund der entstehenden Produkte und isolierbaren Zwischenstufen vermutet werden kann. Standardmethoden zur Strukturaufklärung wie NMR-Spektroskopie, Kristallographie und Massenspektrometrie können nicht für kurzlebige Intermediate verwendet werden. In dieser Dissertation wird gezeigt, dass zweidimensionale Infrarotspektroskopie (2D-IR Spektroskopie) diese Lücke schließen kann und eine exzellente Ergänzung zu den etablierten Methoden zur Strukturaufklärung darstellt. 2D-IR-Spektroskopie verwendet ultrakurze Laserpulse um die Wechselwirkungen zwischen Schwingungen zu messen - analog zur mehrdimensionalen NMR-Spektroskopie, welche die Interaktionen zwischen Spins untersucht. Durch die hohe Zeitauflösung ist 2D-IR-Spektroskopie besonders geeignet, um die beiden Fragestellungen dieser Arbeit zu behandeln: Strukturaufklärung reaktiver Intermediate und Dynamik der Konformationsänderungen von Proteinen. Strukturaufklärung reaktiver Intermediate Der Fokus dieser Arbeit liegt darauf, polarisationsabhängige 2D-IR (P2D-IR)-Spektroskopie als besonders gut geeignete und leistungsfähige Methode zur Strukturaufklärung von kleinen Molekülen und reaktiven Intermediaten einzuführen. Dies wird anhand der Bestimmung der Strukturen von N-Crotonyloxazolidinon (im Folgenden als 1 bezeichnet) und von dessen reaktiven Komplexen mit den Lewis-Säuren SnCl4 und Mg(ClO4)2 gezeigt. N-Crotonyloxazolidinon ist ein kleines organisches Molekül, welches einen chiralen Oxazolidinonring beinhaltet, der auch als Evans-Auxiliar bekannt ist. Chirale Oxazolidinone in Kombination mit Lewis-Säuren werden seit etwa 30 Jahren häufig zur asymmetrischen Synthese verwendet. Dennoch konnten einige Reaktionsmechanismen bisher nur vermutet und nicht experimentell aufgeklärt werden. Durch die sehr genaue Messung der Winkel zwischen den Übergangsdipolmomenten der Streckschwingungen mit einem verbesserten P2D-IRAufbau und durch den Vergleich der Winkel mit DFT-Rechnungen, konnten in dieser Arbeit die dreidimensionalen Strukturen von 1 und den hauptsächlich gebildeten Komplexen 1·SnCl4 und 1·Mg(ClO4)2 eindeutig bestimmt und genau analysiert werden. Strukturelle Feinheiten wie die leichte Verdrehung zwischen dem Oxazolidinonring und der Crotonylkette wurden mittels P2D-IR-Spektroskopie aufgedeckt. Diese Verdrehung ist im Einklang mit der Kristallstruktur, kann aber mit DFT-Rechnungen nicht reproduziert werden. Die Struktur von 1 in Lösung kann mit NMRSpektroskopie nicht eindeutig bestimmt werden, da zu wenige Spin-Spin-Interaktionen vorhanden sind. Zusätzlich zu den dominierenden Komplexen konnten weitere Komplexe in niedrigen Konzentrationen detektiert und vorläufig zugeordnet werden. Die Existenz dieser war bisher unbekannt, ist für das Verständnis der Reaktion und der beobachteten Selektivitäten aber von großer Wichtigkeit. Es wird zudem eine Methode eingeführt, um Mischungen zu analysieren und so die Struktur einzelner Spezies in Gegenwart ähnlicher Moleküle in hohen Konzentrationen zu untersuchen. Diese Arbeit erschließt ein weites Anwendungsgebiet für 2D-IR-Spektroskopie, unter anderem die Untersuchung von Substrat-Katalysator-Komplexen und kurzlebigen Intermediaten, deren Strukturaufklärung bisher nicht möglich war. Konformationsänderungen von Proteinen: 2D-IR-Spektroskopie erlaubt die Untersuchung von Dynamiken, ohne dabei das Gleichgewicht zu stören. Sie ist daher gut geeignet, um schnelle Proteindynamiken zu untersuchen und deren Geschwindigkeitsgrenze zu ergründen. In einem weiteren Teil der Arbeit wird die Temperaturabhängigkeit der Konformationsänderung der Myoglobinmutante L29I untersucht. Myoglobin existiert in unterschiedlichen Konformationen. Wenn Kohlenstoffmonoxid (CO) an die Hämgruppe im Myoglobin gebunden wird, können die unterschiedlichen Konformationen anhand der IR Bande des COs detektiert werden. Die 2D-IR-Messungen zeigen, dass Austauschraten zwischen den Konformationen A1 und A3 im Bereich von 0°C bis 40°C nur sehr gering von der Temperatur abhängen. Eine genaue Analyse dieser Daten und der Vergleich mit früheren Tieftemperaturmessungen macht deutlich, dass die Zeitkonstanten für den Austausch proportional zur Viskosität des Lösungsmittels sind. Diese lineare Abhängigkeit wurde für den Temperaturbereich zwischen -100°C und 40°C nachgewiesen, was einer Änderung der Viskosität und der Zeitkonstanten von 14 Größenordnungen entspricht. Die Rate dieser Konformationsänderung ist folglich durch das Lösungsmittel dominiert. Dies ist der erste experimentelle Beweis für den dominierenden Einfluss des Lösungsmittels auf Raten im Pikosekundenbereich. Aus dem Ergebnis lässt sich schließen, dass sich die beiden Myoglobinkonformationen nur durch großräumige Umorientierungen ineinander umwandeln können und sie sich nicht nur in der Orientierung einzelner Seitenketten unterscheiden. Qualitativ das gleiche Ergebnis wurde für weitere Myoglobinmutanten und den Wildtyp erhalten.