Open Access

Daniela Ploen

• Hepatitis C virus (HCV) assembly and production is closely linked to lipid metabolism. Indeed, lipid droplets (LD) have been shown to serve as a platform for HCV assembly. To investigate the effect of HCV on the host cell proteome, 2D-gelelectrophoresis with subsequent MALDI-TOF mass spectrometry of HCV replicating and the corresponding control cells were done. Based on this analysis, it was found out that HCV-replicating Huh7.5 cells revealed lower amounts of TIP47 (tail interacting protein of 47kD) compared to HCV-negative cells. TIP47, a cytoplasmic sorting factor, has been shown to be associated with lipid droplets. As it is known that HCV-replication and assembly takes place at the so called ”membranous web” that is composed of LDs and rearranged ER-derived membranes, it was tempting to investigate the role of TIP47 in HCV life-cycle. Western blot analysis did reveal that overexpression of TIP47 in HCV replicating Huh7.5 cells leads to decreased amounts of the HCV core protein while the levels of non-structural protein (NS)5A and intracellular HCVgenomes are increased. Moreover, in TIP47 overproducing cells higher amounts of infectious HCV particles are secreted. Vice versa, inhibition of TIP47 expression by siRNA results in a decreased level of intracellular NS5A, increased amounts of intracellular core and less infectious viral particles in the supernatant. In addition, complete silencing of TIP47 by lentiviral transduction abolishes HCV replication that can be restored by transfection of these cells with a TIP47 expression construct. It has been shown recently that apoE binds to NS5A and that this interaction plays an important role for the HCV life cycle (Benga et al., 2010). The C-terminal part of TIP47 harbours a 4 helix bundle motif and displays high homology to the N-terminus of apoE. Therefore, we investigated the interaction of NS5A and TIP47. Confocal double immunofluorescence microscopy revealed that a fraction of NS5A colocalizes with TIP47. Coimmunoprecipitation experiments and a yeast-two-hybrid screening confirmed the interaction between NS5A and TIP47 and deletion of the N-terminal-TIP47-PAT domain abolishes this interaction. From this we conclude that the TIP47-NS5A interaction is required for virus morphogenesis. Moreover, TIP47 can bind to Rab9 and this is relevant for targeting the viral particle out of the cell. In accordance to this, TIP47 was identified to be associated to the viral particle. Mutants of TIP47 that fail to bind Rab9 reveal lower amounts and a changed distribution of the HCV core protein. Furthermore, we could see that the core staining colocalizes with subcellular structures that were identified as autophagosomes using a p62-specific antibody which is a specific autophagosome-marker. Based on this, we hypothized that destruction of the Rab9 binding domain misdirects the viral particle towards the lysosomal compartment. For the first time it could be shown that TIP47 interacts with NS5A and is associated to the viral particle, therefore plays a crucial role for the virus morphogenesis and secretion of the viral article. Taken together, these results indicate that TIP47 is an essential cellular factor for the life cycle of HCV Abstract and might be used as target for antiviral treatment, e.g. by targeting the NS5A-TIP47 interaction, based on small molecules that mimic the NS5A-specific sequence that binds to TIP47 which might result in a competition of the TIP47/NS5A interaction.
• Die chronische Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus ist eine der Hauptursachen für die Entstehung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC). In 50-80 % der Erkrankungsfälle nimmt die Infektion einen chronischen Verlauf (Seef, 2002), wobei 20% der Patienten mit chronischer Hepatitis C eine Leberzirrhose entwickeln, aus der ein Leberzellkarzinom entstehen kann (Branda and Wands, 2006, Bartosch et al., 2009). Die WHO geht von etwa 170 Millionen chronisch HCV-Infizierten weltweit aus, dies entspricht etwa 3% der Weltbevölkerung (Poynard et al., 2003). Im Unterschied zu vielen anderen Infektionskrankheiten ist HCV auch ein Problem in westlichen Industrienationen, so z.B. USA und Deutschland (Prävalenz von 1,8% in den USA und 0,4% in Deutschland (Higuchi et al., 2002)). Eine Prophylaxe in Form einer Vakzine ist derzeit noch nicht verfügbar. Die gegenwärtige Therapie der HCV-Infektion basiert auf einer Kombination von pegyliertem Interferon und Ribavirin (Di Bisceglie and Hoofnagle, 2002, Ferenci, 2006). Allerdings ist die Effizienz (ca. 50-60%) dieses Ansatzes bei gleichzeitigen hohen Kosten sehr begrenzt. Die Entwicklung von Protease-Inhibitoren zur Hemmung der Nicht-Strukturprotein (NS)3/4 verspricht eine effizientere Heilung der Infektion in naher Zukunft (Kronenberger and Zeuzem, 2012). Die Hepatitis-C-Virusmorphogenese findet an den Lipid droplets (LD) statt und ist damit an den Lipidstoffwechsel gekoppelt. Die Freisetzung der Viren ist eng an die VLDL-Synthese gekoppelt, was zur Folge hat, dass die Viruspartikel Triglyzerid-reichen Lipoproteinen (TRL) ähneln (Olofsson et al., 2009). Um den Einfluss des Hepatitis-C-Viruses (HCV) auf das Proteom der Wirtszelle zu charakterisieren, wurde in vorangegangenen Versuchen eine 2D-Gelelektrophorese mit anschließender MALDI-TOF Massenspektrometrie von HCV-positiven Zell-Lysaten und den entsprechenden Kontrollzellen durchgeführt. Dabei konnte das Protein TIP47 (tail interacting protein of 47 kD) identifiziert werden, dessen Proteinmenge in den HCV-replizierenden Zellen deutlich reduziert ist. Dies konnte durch Western Blot Analysen von Zell-Lysaten HCVreplizierender Zellen bestätigt werden (siehe Kapitel 5.1, Abb. 5.1). Desweiteren konnte mittels RT-PCR-Analysen nachgewiesen werden, dass sowohl in HCV-replizierenden Huh7.5 Zellen als auch in infizierten primären humanen Hepatozyten (PHHs) die Expression von TIP47 erhöht war (siehe Kapitel 5.1, Abb. 5.2). Dies lässt vermuten, dass die reduzierten TIP47-Mengen durch eine gesteigerte Genexpression kompensiert werden. Ursprünglich wurde TIP47 als LD-assoziiertes Protein beschrieben, dass für den Rücktransport des Mannose-6-Phosphat-Rezeptors (M6PR) von den späten Endosomen zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) verantwortlich ist. Weiterhin ist beschrieben, dass TIP47 mit LDs assoziiertist (Wolins et al., 2001, Bulankina et al., 2009). Da die HCV-Morphogenese an dem sogenannten membranous web (Moradpour et al., 2003) stattfindet, das aus LDs und rearrangierten ER-Membranen besteht liegt es nahe, den Einfluss von TIP47 auf den HCV-Lebenszyklus zu untersuchen. Zudem ist bekannt, dass TIP47 bei der Morphogenese anderer Viren eine entscheidende Rolle übernimmt. Beim humanen immundefizienz-Virus (HIV) vermittelt TIP47 die Interaktion von Gag (group-specific antigen) und Env (envelope) und ist essentliell für die Freisetzung infektiöser Viren (Lopez-Verges et al., 2006, Bauby et al., 2010). Beim Vacciniavirus (VV) bindet TIP47 an das periphere Membranprotein p37 und ist verantwortlich für die Umhüllung von intrazellulären reifen Viren (IMV) mit Membranen aus späten Endosomen (LE), um intrazelluläre umhüllte Viren (IEV) zu generieren. Mutationen im p37-Bindemotif unterbinden die Interaktion von TIP47 mit p37 und die Bildung infektiöser Viren (Chen et al., 2009). In dieser Arbeit konnte beobachtet werden, dass TIP47 Überproduktion die Menge freigesetzter infektiöser Viruspartikel erhöht, sowie die Virusreplikation steigert. In Western Blot Analysen von Zell-Lysaten HCV-replizierender Zellen, konnte nach Überproduktion von TIP47 erhöhte Mengen an NS5A sowie reduzierte Mengen des Core-Proteins nachgewiesen werden (siehe Kapitel 5.2, Abb. 5.3). NS5A ist ein Virusprotein, das als Regulator der viralen Replikation bekannt ist (Evans et al., 2004) (siehe Kapitel 1.5.7) und somit als Marker für diese verwendet werden kann. Erhöhte NS5A Mengen deuten somit auf eine gesteigerte Virusreplikation hin. Dies konnte in Reportergen Analysen HCV-replizierender Zellen nach TIP47 Überexpression bestätigt werden (siehe Kapitel 5.2 5.4). Da das Core-Protein das Nukleokapsid des Viruspartikels bildet, lassen reduzierte Mengen des Proteins auf eine reduzierte Anzahl von Viruspartikeln in der Zelle vermuten. In Infektionsversuchen konnte dies bestätigt werden, da mehr infektiöse Viruspartikel sekretiert wurden (siehe Kapitel 5.2, Abb. 5.4). Umgekehrt konnte nach Hemmung der TIP47 Expression durch siRNA oder lentivirale Vektoren gefunden werden, dass TIP47 eine wichtige Rolle bei der Virusmorphogenese übernimmt. Im Gegensatz zur Überproduktion konnte in Western Blot Analysen festgestellt werden, dass die Inhibierung von TIP47 zu geringeren Mengen von NS5A und einer Akkumulation des Core-Proteins führt (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.5). Mittels RT-PCR-Analyse konnte eine verminderte TIP47 Replikation detektiert werden. Ebenso zeigen Infektionsversuche eine verminderte Sekretion infektiöser Viruspartikel (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.6). Dies lässt vermuten, dass nach Inhibierung von TIP47 die Assemblierung und Morphogenese der Viruspartikel gestört ist, was zu einer Akkumulation struktureller Bestandteile des Virus in der Zelle führt, gefolgt von einer verminderten HCV-Replikation und somit verminderten Freisetzung infektiöser Viruspartikel. Das vollständige Ausschalten der TIP47-Expression mittels lentiviraler Transduktion führt zu einem kompletten Abbruch der HCV-Replikation, da nach Elektroporation von Huh7.5 Zellen mit dem Replikon JFH1/J6 keine virusspezifischen Proteine nachgewiesen werden können (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.7 (oben links)). Nach Transfektion von Huh7.5 Zellen mit einem TIP47- Expressionsplasmid 24 h vor Elektroporation, konnte die HCV-Replikation wieder hergestellt werden, jedoch konnte im Western Blot kein Core-Protein detektiert werden, was annehmen lässt, dass die Virusmorphogenese immer noch gestört ist (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.7 (oben rechts)). Hinzu kommt, dass die NS5A-spezifische Bande im Western Blot ein kleineres Molkulargewicht als das der NS5A-Kontrolle aufweist (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.7 (oben rechts)). Ebenso zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eine veränderte NS5A-Verteilung in der äußeren Region der Zelle, anstatt in der perinukleären Region (siehe Kapitel 5.3, Abb. 5.7 (unten)). Diese Ergebnisse bestätigen die essentielle Rolle von TIP47 für die Freisetzung infektiöser Viruspartikel. Der C-Terminus von TIP47 besteht aus einem !/"- Motif und einem 4-Helix-Bündel und weist eine hohe Sequenzhomologie zum LDL-Rezeptor bindenden N-Terminus von ApoE auf (Hickenbottom et al., 2004). In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass ApoE mit NS5A interagiert und dies essentiell für die Produktion infektiöser Viren ist (Benga et al., 2010). Mittels konfokaler Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass auch TIP47 mit NS5A interagiert (siehe Kapitel 5.4, Abb. 5.8). Diese Interaktion konnte durch Koimmunopräzipitation und ein Yeast-two-hybrid screening bestätigt werden. Dabei scheint die N-terminale PAT-Domäne essentiell zu sein, da eine Deletion dieser Domäne eine Interaktion mit NS5A verhindert (siehe Kapitel 5.4, Abb. 5.11). Dies konnte durch Affinitätschromatographie-Analyse bestätigt werden (siehe Kapitel 5.4, Abb. 5.10). Wie bereits erwähnt, ist der HCV-Lebenszyklus eng an den Lipidstoffwechsel gekoppelt. Das membranous web, das aus LDs und rearrangierten ER-Membranen besteht und an dem die Virusmorphogenese stattfindet, enthält große Mengen an Proteinen, die für die VLDL-Synthese benötigt werden, wie z.B. apoB, apoE und das mikrosomale Triglyzerid Transferprotein (MTP) (Huang et al., 2007). In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass apoE an das Viruspartikel gebunden ist (Benga et al., 2010). Da TIP47 eine hohe Sequenzhomologie zu apoE aufweist und über eine N-terminale 11mer Wiederholungssequenz zu den LDs rekrutiert wird (Bulankina et al., 2009) liegt die Vermutung nahe, dass auch TIP47 während der Virusmorphogenese und Sektretion an die viralen Lipoproteinpartikel (VLP) gebunden wird. Mittels konfokaler Laser-Scan-Mikroskopie konnte beobachtet werden, dass TIP47 teilweise mit dem Core-Protein kolokalisiert (siehe Kapitel 5.5, Abb. 5.12). Affinitätschormatographie-Analyse und Koimmunpräzipitation HCV-positiver Zellkulturüberstände, sowie die Virusanreicherung aus HCV-positiven Überstände über einen Sucrose-Gradienten bestätigen experimentell die Hypothese, dass TIP47 Teil des Viruspartikels ist (siehe Kapitel 5.5, Abb. 5.13, 5.15, 5.14). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Präinkubation von HCV-positiven Überständen mit TIP47-spezifischen Antikörpern die Infektionseffizienz dieser senkt (siehe Kapitel 5.5, Abb. 5.16). TIP47 ist als intrazellulärer Faktor bekannt, der an dem Rücktransport des M6PR von den LE zum TGN beteiligt ist (Diaz and Pfeffer, 1998). Durch Bindung von zytosolischem TIP47 an aktiviertes GTP-gebundenes Rab9 (Ras analogon in brain) wird dieser Transport erleichtert (Carroll et al., 2001). Rab-GTPasen sind an intrazellulären Transportprozessen beteiligt indem sie die Vesikel mit ihren Targetmembranen verbinden (Zerial and McBride, 2001). Die Amino-säuren 151-169 von TIP47 enthalten das Rab9-Bindemotiv und sind somit essentiell für die TIP47/Rab9 Interaktion (Carroll et al., 2001). Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie Analysen bestätigen die Interaktion von TIP47 und Rab9 (siehe Kapitel 5.6, Abb. 5.17). Zusätzlich wurde gefunden, dass TIP47 Mutanten, die nicht mehr in der Lage sind Rab9 zu binden, weiterhin NS5A binden können (siehe Kapitel 5.4, Abb. 5.9) da sich die TIP47/NS5A-Bindedomäne von der TIP47/Rab9-Bindedomäne unterscheidet (siehe Kapitel 5.4, Abb. 5.11). Mittels Koimmunopräzipitation von Zell-Lysaten HCV-replizierender Zellen sowie Immunfluoreszenz-Analyse konnte bestätigt werden, dass Rab9 an den TIP47/NS5A Komplex bindet (siehe Kapitel 5.6, Abb. 5.19, 5.18). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion essentiell für den Transport reifer Viruspartikel aus der Zelle ist. In Western Blot Analysen von Zell-Lysaten HCV-replizierender Zellen, die TIP47-Deletionsmutanten überexprimieren, konnten geringere Mengen des Core-Proteins in der Zelle nachgewiesen werden (siehe Kapitel 5.7, Abb. 5.20). Ebenso zeigt die Immunfluoreszenz-Analyse eine veränderte Verteilung des Core-Proteins mit intrazellulären Strukturen, die unter Verwendung eines spezifischen Markers (p62) als Autophagosomen identifiziert werden konnten (siehe Kapitel 5.7, Abb. 5.21, 5.22). p62 ist ein Ubiquitin-Adapter, der polyubiquitinylierte, missgefaltetet und aggregierte Proteine bindet und somit für den autophagosomalen Abbau kenntlich macht (Moscat and Diaz-Meco, 2009). Inhibierung der lysosomalen Aktivität durch Inkubation der Zellen, die die TIP47 Deletionsmutanten überproduzieren, mit NH4Cl oder BFLA-1 (Bafilomycin) führt wieder zu erhöhten Mengen des Core-Proteins (siehe Kapitel 5.7, Abb. 5.23). NH4Cl oder BFLA-1 inhibieren die Ansäuerung der endosomalen Vesikel. NH4Cl ist eine schwache Base, die im sauren Milieu protoniert wird und somit die Umgebung der endozytotischen Vesikel neutralisiert. BFLA-1 inhibiert die vakuoläre H+-ATPase und verhindert somit die Ansäuerung des endosomalen Kompartiments (Fredericksen et al., 2002). Aus diesem Grunde liegt die Vermutung nahe, dass die TIP47/Rab9-Interaktion essentiel für den Transport der reifen Viruspartikel aus der Zelle ist. Wird die Bindung von Rab9 an TIP47 verhindert, so wird der Transport des HCV-TIP47 Komplex gestört ist und dieser mittels Autophagie abgebaut. Im Einklang damit, konnte in Western Blot Analysen nach Inhibierung von Rab9, geringere Mengen des Core-Proteins nachgewiesen werden (siehe Kapitel 5.7, Abb. 5.24). Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit das erste Mal gezeigt werden, dass das intrazelluläre Protein TIP47 zwei entscheidende Rollen im HCV-Lebenszyklus übernimmt. Zum einen ist es an dem Transport des neu synthetisierten NS5A-gebundenen-viralen Genoms vom Replikationskomplex (RC) zur Oberfläche der LDs beteiligt, dem Ort der HCV Morphogenese. Danach fungiert es als essentieller Faktor an dem Transport der Viruspartikel aus der Zelle. Es konnte beobachtet werden, dass TIP47 direkt mit NS5A interagiert und somit den Transport vom RC zum Core-Protein auf der Oberfläche der LDs erleichtert. Inhibierung von TIP47 unterbricht diesen ”Shuttle” und führt zur Akkumulation von viralen Strukturproteinenen in der Zelle. Zum anderen ist TIP47 am Transport des Virus aus der Zelle beteiligt, wobei TIP47 Teil des Viruspartikels wird. Hierfür ist die Interaktion mit Rab9 essentiell. Deletion der Rab9-Bindedomäne führt zum Abbau der neu synthetisierten Partikel mittels Autophagie. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TIP47 eine essentielle Rolle bei der Virusmorphogenese und Sekretion reifer Viruspartikel übernimmt und ein wichtiger zellulären Faktor im HCV-Lebenszyklus darstellt. TIP47 könnte somit ein Ziel für die antivirale Therapie darstellen unter Verwendung von sogenannten small molecules. Dies führt zu einer Inhibierung der TIP47/NS5A Interaktion und folglich wird der Transport der neu synthetisierte NS5Agebundenen viralen RNA vom RC zur Oberfläche der LDs unterbrochen. Neben dem direkt inhibierenden Effekt auf die HCV-Replikation könnte es auch zu einer verstärkten Degradation der akkumulierten Proteine und somit zu einer verstärkten Präsentation HCV-spezifischer Peptide auf der Zelloberfläche kommen - eine Vorraussetzung für eine effiziente Elimination durch die zelluläre Immunantwort.