Open Access

Sabine Willems

• Nukleäre Rezeptoren (NRs) sind ligandenaktivierte Transkriptionsfaktoren, die an der Regulation unzähliger (patho-)physiologischer Prozesse im Körper beteiligt sind, wodurch sie interessante therapeutische Zielstrukturen darstellen. Unter ihnen zählen die PPARs (α, γ und δ) zur Hälfte der gut erforschten NRs. Sie haben als Lipidsensoren vor allem metabolische Funktionen und ihre synthetischen Liganden sind als Arzneistoffe zugelassen, sind anderen Therapieoptionen jedoch aufgrund geringerer Wirksamkeit und klassenspezifischer Nebenwirkungen unterlegen. Daher ist der Bedarf an neuen Konzepten zur selektiven Modulation der PPARs groß. Den gut studierten NRs gegenüber steht die andere Hälfte der NRs, deren Funktionen noch nicht umfassend verstanden sind. Nurr1 ist ein solcher NR, dem großes therapeutisches Potential bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer-Demenz und Multipler Sklerose zugeschrieben wird. Der konstitutiv aktive NR wird hauptsächlich im ZNS, und dort vor allem in dopaminergen Neuronen, exprimiert, wo er neuroprotektive und anti-entzündliche Effekte vermittelt. Trotz der jüngsten Erkenntnisse zu potenziellen endogenen Liganden der direkten Interaktion der Nurr1-Ligandbindedomäne (LBD) mit kleinen, wirkstoffartigen Molekülen, mangelt es an geeigneten chemischen Tools, um die Nurr1-Modulation als neues therapeutisches Konzept zu validieren. Ziel dieser Arbeit war daher die Identifikation, Entwicklung und Charakterisierung neuer tool compounds für die PPARs und Nurr1. Das Konzept der Photopharmakologie eröffnet neue Möglichkeiten in der zeitlichen und räumlichen Kontrolle biologischer Effekte. Mit Hilfe computergestützten Designs wurden aus dem PPARγ-Agonist Rosiglitazon und dem pan-PPAR-Agonist GL479 Azobenzen-basierte photoschaltbare PPAR-Agonisten entwickelt und optimiert. Das Rosiglitazon-Azolog 36 wurde durch terminale Erweiterung als cis-präferenzieller selektiver PPARγ-Agonist erhalten, der durch Licht aktiviert werden konnte. Aus GL479 ging zum einen 38 als hochpotenter und selektiver PPARα-Agonist hervor, der in seiner trans-Konfiguration 35-mal potenter war als das entsprechende cis-Isomer. Zum anderen wurde ein dualer trans-präferenzieller PPARα- und -δ-Agonist (41) entwickelt. In einem eigens etablierten Fluoreszenz-Reportergenassay konnte durch die neuen photopharmakologischen Tools die PPAR-Aktivität in lebenden Zellen im zeitlichen Verlauf kontrolliert werden. Auch die Identifikation und Charakterisierung endogener Liganden ist von großer Relevanz für die Modulation von NRs. Mit der Entdeckung der PPARγ-Aktivierung durch Garcinolsäure (48), einem Vitamin-E-Metaboliten, konnte ein neuer Aktivierungsmechanismus aufgedeckt werden, der ein besonderes Co-Regulator-Interaktionsprofil umfasst. Eine Co-Kristallstruktur der PPARγ-LBD im Komplex mit 48 zeigte, dass 48 sowohl die orthosterische als auch eine neue allosterische Bindestelle adressiert. Eine Genexpressionsanalyse in humanen Hepatozyten zeigte, dass sich dieser besondere Aktivierungsmechanismus von 48 auch in einer differenzierten Modulation der PPARγ-regulierten Genexpression widerspiegelte, woraus sich mögliche therapeutische Anwendungen für eine selektiv allosterische PPAR-Modulation ableiten lassen. Der erste Ansatz zur Suche nach Nurr1-Modulatoren als tool compounds war von den Prostaglandinen A1 und A2 als potenziellen endogenen Nurr1-Liganden inspiriert. Da diese Entzündungsmediatoren durch Aktivität der Cyclooxygenasen (COX) 1 und 2 entstehen, entstand die Hypothese, dass synthetische COX-Inhibitoren, auch bekannt als nichtsteroidale Antirheumatika (NSARs), Nurr1 modulieren könnten. Dies konnte in einem Screening von 39 strukturell diversen NSARs im Gal4-Nurr1-Reportergenassay bestätigt werden. Mit Meclofenaminsäure als differenziellem Nurr1-Modulator sowie Oxaprozin und Parecoxib als den ersten inversen Nurr1-Agonisten konnte dabei außerdem gezeigt werden, dass die hohe konstitutive Nurr1-Aktivität bidirektional moduliert werden kann, und dass sowohl das Co-Regulator-Rekrutierungsprofil als auch das Dimerisierungsverhalten an der Vermittlung von Nurr1-Ligand-Effekten entscheidend beteiligt sind. Die zweite Strategie beruhte auf den alten Antimalariawirkstoffen Amodiaquin (19) und Chloroquin (25), die zuvor als moderate Nurr1-Agonisten (EC50 Nurr1: 36 µM (19), 47 µM (25)) identifiziert wurden, aber aufgrund zahlreicher unspezifischer Effekte für den breiten Einsatz als tool compounds für Nurr1 ungeeignet sind. Eine Evaluation der einzelnen Strukturmerkmale dieses Chemotyps zeigte, dass das gemeinsame 7-Chlorochinolin-4-amin Grundgerüst ausreichend ist, um Nurr1 zu aktivieren (EC50 Nurr1: 259 µM). Basierend auf dieser Erkenntnis gingen durch gezielte Strukturmodifikationen dieses Grundgerüstes die Nurr1-Agonisten 71 und 73 hervor (EC50 Nurr1: 7,3 µM (71), 17 µM (73)), die die Leitstrukturen in ihrer Potenz übertrafen...
• Nuclear receptors (NRs) are ligand-activated transcription factors involved in the regulation of numerous (patho)physiological processes, such as cell differentiation, metabolism, and inflammation, thus representing attractive therapeutic targets. Among them, the peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) α, γ, and δ belong to the well-studied NRs. As lipid sensors, they mainly exert metabolic functions in glucose and lipid metabolism and synthetic PPAR agonists (PPARα: fibrates, PPARγ: glitazones) have received drug approval. However, their therapeutic application is limited due to lower efficacy compared to alternative options and undesirable side effects caused by their primary mode of action. New concepts to selectively modulate the PPARs while avoiding the class-specific side effects are therefore urgently needed. For the second half of the NR family, the so-called orphan receptors, roles and functions are not comprehensively studied, yet. Among them, Nurr1 is considered to have great therapeutic potential in neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis. The constitutively active NR is mainly expressed in the central nervous system – especially in dopaminergic neurons – where it seems to mediate neuroprotective and anti-inflammatory effects. Despite recent findings of potential endogenous ligands and evidence for a direct interaction of the Nurr1 ligand-binding domain (LBD) with small, drug-like molecules, there is a lack of suitable chemical tools to validate Nurr1 modulation as a novel therapeutic approach. Accordingly, the aim of this thesis was to identify, develop, and characterize new tool compounds for the PPARs and Nurr1. The concept of photopharmacology opens new possibilities in the temporal and spatial control of biological effects of drug-like molecules, which made it attractive for application to PPARs. Computeraided design was used to develop azobenzene-based photoswitchable PPAR agonists from the PPARγ agonist rosiglitazone (3) and the pan-PPAR agonist GL479 (29), which were subsequently optimized for subtype selectivity and preferred activity of either configuration. The rosiglitazone azolog 36 was obtained by terminal extension as a cis-preferential PPARγ selective agonist that could be activated by light. Based on 29, targeted structural modifications resulted firstly in 38 as a highly potent and selective PPARα agonist, whose trans configuration exhibited 35-fold higher potency than the cis-counterpart. Secondly, a dual trans-preferential PPARα- and -δ-agonist (41) with balanced activation efficiencies and potencies at both receptors was developed. In a dedicated fluorescent reporter gene assay, these new photopharmacological tools allowed for the control of PPAR activity in living cells over time. In addition to photopharmacology as a new strategy in the field of NRs, the identification and characterization of endogenous ligands is also of great relevance. The discovery of PPARγ activation by the vitamin E metabolite garcinoic acid (48) revealed a new activation mechanism with a distinct coregulator interaction profile. A co-crystal structure of the PPARγ LBD in complex with 48 demonstrated that 48 addresses the orthosteric as well as an allosteric binding site. Gene expression analysis in human hepatocytes showed that the special PPAR activation mechanism of 48 was also reflected in differential modulation of PPARγ-regulated gene expression, potentially suggesting therapeutic implications for selectively addressing this allosteric binding site. Nurr1 appears to hold great therapeutic potential but there is a lack of Nurr1 ligands as tools. The search for new Nurr1 modulators by various strategies was hence a major topic of this thesis. The first approach to Nurr1 ligand discovery was inspired by the prostaglandins A1 and A2 as potential endogenous Nurr1 ligands, which are inflammatory mediators generated by cyclooxygenase (COX) 1 and 2 activity. Therefore, it was hypothesized that synthetic COX inhibitors, also known as nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), might modulate Nurr1, and screening of 39 structurally diverse NSAIDs for Nurr1 activity confirmed this assumption. Meclofenamic acid (49) was discovered as a differential Nurr1 modulator, oxaprozin (51) and parecoxib (52) emerged as the first-in-class inverse Nurr1 agonists demonstrating that the high constitutive Nurr1 activity can be modulated bidirectionally. Further studies with NSAIDs as tools showed that both the co-regulator recruitment profile and dimerization equilibria of Nurr1 are critically involved in mediating ligand effects...