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Anna Wacker

• Der 2‘-Desoxyguanosin-Riboschalter gehört zur unter Bakterien weit verbreiteten Klasse der Purin-Riboschalter. Allerdings wurden 2‘-Desoxyguanosin-bindende Riboschalter bisher ausschließlich in M. florum gefunden, damit stellt diese RNA eine Ausnahme unter den ansonsten verbreiteten Purin-Riboschaltern dar. In der vorliegenden Arbeit wurde ein NMR-Strukturmodell des IA-Aptamer-2‘-Desoxyguanosinkomplexes erstellt und anhand der mittels NMRSpektroskopie zugänglichen strukturellen Informationen sowohl Struktur und Dynamik des freien RNA-Aptamers als auch des 2‘-Desoxyguanosinkomplexes charakterisiert. Dabei wurde insbesondere der Einfluss von Mg2+ auf Struktur und Dynamik der jeweiligen Zustände sowie auf den durch 2‘-Desoxyguanosin induzierten Faltungsprozess untersucht. Mg2+-Ionen modulieren die Faltungstrajektorien von sensorischen RNA-Domänen. Die Übertragbarkeit von Mg2+-abhängigen Charakteristika der RNA-Faltung innerhalb verschiedener Messmethoden ist durch die schlechte Vergleichbarkeit der relativen Konzentrationsverhältnisse eingeschränkt. Die NMR-spektroskopisch beobachtbaren Mg2+-Einflüsse sollten also unter besonderer Berücksichtigung der für NMR benötigten vergleichsweise sehr hohen RNAKonzentrationen mit Ergebnissen aus kalorimetrischen oder fluoreszenzspektroskopischen Messungen interpretiert werden. Die in der NMR-Spektroskopie üblichen hohen Probenkonzentrationen befinden sich in dem Regime, in dem auch der physikalische Effekt des verdrängten Volumens eine Rolle zu spielen beginnt. Demnach ist es für die RNA-Moleküle im NMR-Probenröhrchen bei Konzentrationen von 5-10 mg/ml auch ohne Zugabe von Mg2+ entropisch günstiger, kompakte Konformationen einzunehmen. Die Relevanz des Effekts des verdrängten Volumens für die RNA-Faltung unter NMR-Bedingungen und unter zellulären Bedingungen ist Gegenstand der aktuellen Forschung und wird in dieser Arbeit am Beispiel des IA-Aptamers diskutiert. Der oft einzigartige Bindungsmodus ubiquitärer Metaboliten durch bakterielle Riboschalter (Montange and Batey, 2006) ermöglicht prinzipiell den Einsatz von RNA-Aptameren in vivo, ohne mit zellulären Proteinsystemen zu interferieren (Mulhbacher et al., 2010). Therapeutische Ziele sind beispielsweise die Anwendung von Riboschaltern gegen bakterielle Pathogene beziehungsweise gegen pathogene Bakterien selbst. Eine weitere Rolle wird RiboschalterElementen zukünftig als Bausteine in der synthetischen Biologie zukommen (Dixon et al., 2010; Knight, 2003; Topp and Gallivan, 2008). Hierfür ist es von grundlegender Bedeutung, Charakterisierung von Struktur als Basis für das Verständnis von Funktion unter zellulären Bedingungen zu etablieren. Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit Robert Hänsel aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Volker Doetsch wurde am Beispiel des IA-Aptamers und einer nichtnatürlichen Sequenzvariante gezeigt, dass eine strukturelle Charakterisierung von Riboschaltern mittels in cell NMR-Spektroskopie möglich ist. In Zusammenarbeit mit Karl von Laer aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Beatrix Suess wurden beide RNA-Aptamer hinsichtlich ihrer Funktion in einem biologischen Assay getestet. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten eine deutliche Korrelation von Struktur und Funktion in vivo, während Diskrepanzen zwischen Struktur in vitro und Funktion in vivo demonstriert werden. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass eine gewisse strukturelle Flexibilität der Bindungstaschen regulatorischer RNA-Motive für Selektion und Adaption während Evolution nötig ist. Beispielsweise wurde für den Guanin-Riboschalter gezeigt, dass der nicht-native Ligand 2‘-Desoxyguanosin zur Komplexbildung des Aptamers führt. Demnach könnte die Bindung von 2‘-Desoxyguanosin im Guanin-Riboschalter bereits evolutionär angelegt sein und die Entstehung des IA-Aptamers nach Genomreduktion der Mesoplasmen begünstigt haben. Das IA-Aptamer dagegen bindet Guanin nicht, stattdessen besitzt M. florum auf Guanin spezialisierte Sequenzvarianten dieses Riboschalters (Kim et al., 2007). Strukturell hochauflösende Einblicke in unterschiedliche Zustände der Bindungstasche im G-Aptamer-Thioguaninkomplex, die durch die Lösung der Kristallstruktur des GLoop-Aptamers ermöglicht wurden, unterstützen die Hypothese einer anpassungsfähigen Bindungstasche im G-Aptamer. Für B. subtilis wäre es interessant, die physiologische Bedeutung der Komplexbildung des G-Aptamers mit 2‘-Desoxyguanosin zu untersuchen.