Open Access

Amelie Bergs

• This dissertation constitutes a series of successive research papers, starting with the characterization of various optogenetic tools up to the establishment of purely optical electrophysiology in living animals. Optogenetics has revolutionized neurobiology as it allows stimulation of excitable cells with exceptionally high spatiotemporal resolution. To cope with the increasing complexity of research issues and accompanying demands on experimental design, the broadening of the optogenetic toolbox is indispensable. Therefore, one goal was to establish a wide variety of novel rhodopsin-based actuators and characterize them, among others, with respect to their spectral properties, kinetics, and efficacy using behavioral experiments in Caenorhabditis elegans. During these studies, the applicability of highly potent de- and hyperpolarizers with adapted spectral properties, altered ion specificity, strongly slowed off-kinetics, and inverted functionality was successfully demonstrated. Inhibitory anion channelrhodopsins (ACRs) stood out, filling the gap of long-sought equivalent hyperpolarizing tools, and could be convincingly applied in a tandem configuration combined with the red-shifted depolarizer Chrimson for bidirectional stimulation (Bidirectional Pair of Opsins for Light-induced Excitation and Silencing, BiPOLES). A parallel study aimed to compare various rhodopsin-based genetically encoded voltage indicators (GEVIs) in the worm: In addition to electrochromic FRET-based GEVIs that use lower excitation intensity, QuasAr2 was particularly convincing in terms of voltage sensitivity and photostability in C. elegans. However, classical optogenetic approaches are quite static and only allow perturbation of neural activity. Therefore, QuasAr2 and BiPOLES were combined in a closed-loop feedback control system to implement the first proof-of-concept all-optical voltage clamp to date, termed the optogenetic voltage clamp (OVC). Here, an I-controller generates feedback of light wavelengths to bidirectionally stimulate BiPOLES and keep QuasAr’s fluorescence at a desired level. The OVC was established in body wall muscles and various types of neurons in C. elegans and transferred to rat hippocampal slice culture. In the worm, it allowed to assess altered cellular physiology of mutants and Ca2+-channel characteristics as well as dynamical clamping of distinct action potentials and associated behavior. Ultimately, the optogenetic actuators and sensors implemented in the course of this cumulative work enabled to synergistically combine the advantages of imaging- and electrode-based techniques, thus providing the basis for noninvasive, optical electrophysiology in behaving animals.
• Diese Dissertation umfasst eine Reihe aufeinander folgender Publikationen, beginnend mit der Charakterisierung verschiedener optogenetischer Werkzeuge bis hin zur Etablierung rein optischer Elektrophysiologie in lebenden Tieren. Die Optogenetik revolutionierte die Neurobiologie, da sie die Stimulation erregbarer Zellen mit außergewöhnlich hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. Um der zunehmenden Komplexität von Forschungsfragen und den damit verbundenen Anforderungen an die Versuchsplanung gerecht zu werden, ist die Erweiterung der optogenetischen Toolbox unerlässlich. Ein Ziel war es daher, eine Vielzahl neuartiger Rhodopsin-basierter Aktuatoren zu etablieren und diese mithilfe von Verhaltensexperimenten u.a. hinsichtlich ihrer spektralen Eigenschaften, Kinetik und Effizienz in Caenorhabditis elegans zu charakterisieren. Dabei konnte die Anwendbarkeit von hochpotenten de- und hyperpolarisierenden Werkzeugen mit angepassten spektralen Eigenschaften, veränderter Ionenspezifität, stark verlangsamter Off-Kinetik und invertierter Funktionalität erfolgreich demonstriert werden. Inhibitorische Anion Channelrhodopsins (ACRs) erwiesen sich als besonders vielversprechend – diese stehen nun den Cation Channelrhodopsins (CCRs) als gleichwertig potente hyperpolarisierende Werkzeuge entgegen. ACR2 konnte zudem in einer Tandemkonfiguration in Kombination mit dem rotverschobenen depolarisierenden Channelrhodopsin Chrimson für eine bidirektionale Stimulation eingesetzt werden (Bidirectional Pair of Opsins for Light-induced Excitation and Silencing, BiPOLES). In einer parallellaufenden Studie wurden verschiedene Rhodopsin-basierte genetisch kodierte Spannungsindikatoren (GEVIs) im Wurm verglichen: Neben e(lectrochromic)FRET-basierten GEVIs, die geringere Anregungsintensität benötigen, überzeugte vor allem QuasAr2 durch seine Spannungsempfindlichkeit und Photostabilität in C. elegans. Da klassische optogenetische Ansätze jedoch eher statischer Natur sind und nur eine Störung der neuronalen Aktivität erlauben, wurden QuasAr2 und BiPOLES kombiniert und in einen geschlossenen Regelkreis mit Rückkopplung eingebunden, um die bisher erste rein optische Spannungsklemme, die so genannte optogenetische Spannungsklemme (optogenetic voltage clamp, OVC), zu realisieren. Hier erzeugt ein I-Regler ein Feedback von Lichtwellenlängen, um BiPOLES bidirektional zu stimulieren und die Fluoreszenz von QuasAr2 auf einem gewünschten Niveau zu halten. Die OVC wurde in Körperwandmuskeln und verschiedenen Arten von Neuronen in C. elegans etabliert und auf organotypische hippokampale Slice-Kultur aus der Ratte übertragen. Im Wurm konnten so Veränderungen in der Zellphysiologie von Mutanten nachgewiesen und Charakteristika von Ca2+-Kanälen untersucht werden. Zudem konnte die OVC eingesetzt werden, um einzelne Aktionspotentiale und das damit verbundene Verhalten dynamisch zu unterdrücken. Letztlich ermöglichten die im Rahmen dieser kumulativen Arbeit implementierten optogenetischen Aktuatoren und Spannungssensoren eine synergetische Kombination der Vorteile von Imaging und elektrodenbasierten (Patch-Clamp) Techniken und eröffnen damit die Möglichkeit nichtinvasiver, optischer Elektrophysiologie in lebenden Tieren.