Heterologous production and characterization of selected G-protein-coupled receptors and G-proteins for structural and functional studies
- G-protein-coupled receptors (GPCRs) from the largest family of receptors in the human body. They contain seven transmembrane helices. There are roughly 800-900 GPCR genes expressed in humans encoded by 4-5% of the human genome. These receptors are the most important signal transducers and play a crucial role in cell physiology and pathology, by using various extracellular stimuli to start complex intracellular signaling. GPCRs interact with a wide variety of stimuli from small molecules (photons, ions, amines) to large molecules (peptides, small proteins), and trigger downstream cascade effects by interacting with G-proteins, GPCR kinases, and ß-arrestin. Because of their crucial roles in many cellular functions, GPCRs are the most important drug targets for the pharmaceutical industry. Approximately 30% of the clinically approved drugs available in the market are against GPCRs. In this work achieved successful expression and purification of GPCRs from class-C and class-A families. Combined with biochemical experiments, DNP-ssNMR, and molecular simulation helped to decipher the mechanism of crosstalk between the allosteric modulator, and the orthosteric binding sites of the peptide receptor. The main findings and major highlights of this dissertation are outlined in the following paragraphs. The calcium-sensing receptor (CaSR) belongs to the GPCR class-C family and contains a large extracellular domain. This receptor regulates Ca2+ homeostasis in blood and its absorption in the kidney and bone. To understand the molecular and structural mechanisms of these receptors their cDNAs were cloned into the pPICZ and pOET1 vectors to express them in Pichia pastoris and in Sf9 insect cells respectively. The CaSR was successfully expressed heterologously in Pichia pastoris and in the insect cell with high yield. The purified receptor purified in LMNG shows no aggregation in a monomeric state. Further optimization was performed to use it for cryo-EM sample preparation and structure determination. In 2nd part of the thesis, different mini G (mini Gs, mini Gi, mini Gqs, and mini Gsi) DNA constructs were made and expressed in E. coli. It's challenging to obtain active GPCR structures due to the instability of G-protein or G-protein-bound receptors. In this work, all mini-G proteins and chimera mini-G-protein-maltose binding protein (MBP) were cloned and expressed in E. coli and purified with a His-trap column with high purity. In the last part of the thesis, to decipher the mechanism of allosteric modulation of orthosteric binding sites in the bradykinin receptor was produced and characterized in insect cells. Angiotensin I converting enzyme inhibitors (ACEIs), are very important drugs and are widely used for the treatment of hypertension, congestive heart failure, and diabetic neuropathy. These drugs target primarily the catalytic zinc center of the ACE. It has been shown that enalaprilat, a well-known ACEI, binds to a proposed zinc-binding site on hB1R and even directly activates the receptor. To obtain information on the influence of ACEIs on the receptor-peptide complex, and to have a better understanding of the molecular mechanism and structural plasticity of the bradykinin receptor and PAM, we used the three commercially available ACEIs captopril, enalaprilat, and lisinopril for our studies. An important result of this thesis is that though enalaprilat, captopril, and lisinopril all have similar functional properties in humans, each one regulates the orthosteric binding site of hB1R in a unique way. These findings provide atomic insights into the allosteric modulation of the bradykinin receptor. This study along with the effects of ACEI on the binding sites of receptors also deciphers the effects of the Zn2+ as well as the crosstalk between zinc binding sites and ACEI compounds. The binding of allosteric modulators induces distinct endogenous binding, which might aid in creating new possibilities in the pharmaceutical field.
- G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Rezeptorfamilie im menschlichen Körper. Sie enthalten sieben Transmembranhelices. Es gibt etwa 800-900 GPCR-Gene, die beim Menschen exprimiert werden und für die 4-5 % des menschlichen Genoms kodieren. Diese Rezeptoren sind die wichtigsten Signalüberträger und spielen eine entscheidende Rolle in der Zellphysiologie und -pathologie, indem sie verschiedene extrazelluläre Stimuli nutzen, um komplexe intrazelluläre Signalprozesse in Gang zu setzen. GPCRs interagieren mit einer Vielzahl von Reizen, von kleinen Molekülen (Photonen, Ionen, Amine) bis hin zu großen Molekülen (Peptide, kleine Proteine), und lösen durch Interaktion mit G-Proteinen, GPCR-Kinasen und -Arrestin nachgeschaltete Kaskadeneffekte aus. Aufgrund ihrer entscheidenden Rolle bei vielen Zellfunktionen sind GPCRs die wichtigsten Angriffspunkte für die pharmazeutische Industrie. Etwa 30 % der auf dem Markt befindlichen klinisch zugelassenen Medikamente richten sich gegen GPCRs. In dieser Arbeit wurde die erfolgreiche Expression und Reinigung von GPCRs aus Klasse-C- und Klasse-A-Familien erreicht. In Kombination mit biochemischen Experimenten, DNP-ssNMR und molekularen Simulationen konnte der Mechanismus des Zusammenspiels zwischen dem allosterischen Modulator und den orthosterischen Bindungsstellen des Peptidrezeptors entschlüsselt werden. Die wichtigsten Ergebnisse und Highlights dieser Dissertation werden in den folgenden Abschnitten beschrieben. Der Calcium-Rezeptor (CaSR) gehört zur GPCR-Klasse-C-Familie und enthält eine große extrazelluläre Domäne. Dieser Rezeptor reguliert die Ca2+-Homöostase im Blut und seine Aufnahme in Niere und Knochen. Um die molekularen und strukturellen Mechanismen dieser Rezeptoren zu verstehen, wurden ihre cDNAs in die Vektoren pPICZ und pOET1 kloniert, um sie in Pichia pastoris bzw. in Sf9-Insektenzellen zu exprimieren. Der CaSR wurde erfolgreich heterolog in Pichia pastoris und in der Insektenzelle mit hoher Ausbeute exprimiert. Der gereinigte Rezeptor, der in LMNG gereinigt wurde, zeigt keine Aggregation in einem monomeren Zustand. Weitere Optimierungen wurden durchgeführt, um ihn für die Kryo-EM-Probenpräparation und Strukturbestimmung zu verwenden. Aufgrund der Instabilität von G-Proteinen oder G-Protein-gebundenen Rezeptoren ist es eine Herausforderung, aktive GPCR-Strukturen zu erhalten. In dieser Arbeit wurden alle Mini-G-Proteine und die Chimäre Mini-G-Protein-Maltosebindungsprotein (MBP) kloniert und in E. coli exprimiert und mit einer His-Trap-Säule mit hoher Reinheit gereinigt. Im letzten Teil der Arbeit wurde der Mechanismus der allosterischen Modulation von orthosterischen Bindungsstellen im Bradykinin-Rezeptor in Insektenzellen hergestellt und charakterisiert. Angiotensin-I-Converting-Enzyme-Inhibitoren (ACEIs) sind sehr wichtige Medikamente und werden häufig zur Behandlung von Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und diabetischer Neuropathie eingesetzt. Diese Medikamente zielen in erster Linie auf das katalytische Zinkzentrum des ACE ab. Es hat sich gezeigt, dass Enalaprilat, ein bekanntes ACEI, an eine vorgeschlagene Zink-Bindungsstelle auf hB1R bindet und den Rezeptor sogar direkt aktiviert. Um Informationen über den Einfluss von ACEIs auf den Rezeptor-Peptid-Komplex zu erhalten und den molekularen Mechanismus und die strukturelle Plastizität des Bradykinin-Rezeptors und des PAMs besser zu verstehen, haben wir die drei kommerziell erhältlichen ACEIs Captopril, Enalaprilat und Lisinopril für unsere Studien verwendet. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist, dass Enalaprilat, Captopril und Lisinopril zwar alle ähnliche funktionelle Eigenschaften beim Menschen haben, aber jedes von ihnen die orthosterische Bindungsstelle des hB1R auf einzigartige Weise reguliert. Diese Befunde bieten atomare Einblicke in die allosterische Modulation des Bradykininrezeptors. Diese Studie entschlüsselt neben den Auswirkungen von ACEI auf die Bindungsstellen von Rezeptoren auch die Auswirkungen von Zn2+ sowie das Zusammenspiel zwischen Zinkbindungsstellen und ACEI-Verbindungen. Die Bindung von allosterischen Modulatoren führt zu einer unterschiedlichen endogenen Bindung, die neue Möglichkeiten im pharmazeutischen Bereich eröffnen könnte.
Author: | Aditya Prasad PatraGND |
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URN: | urn:nbn:de:hebis:30:3-742193 |
DOI: | https://doi.org/10.21248/gups.74219 |
Place of publication: | Frankfurt am Main |
Referee: | Clemens GlaubitzORCiDGND, Hartmut MichelORCiDGND |
Advisor: | Hartmut Michel |
Document Type: | Doctoral Thesis |
Language: | English |
Date of Publication (online): | 2023/06/09 |
Year of first Publication: | 2023 |
Embargo Date: | 2023/05/31 |
Publishing Institution: | Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg |
Granting Institution: | Johann Wolfgang Goethe-Universität |
Date of final exam: | 2023/05/31 |
Release Date: | 2023/06/22 |
Page Number: | 157 |
HeBIS-PPN: | 508994292 |
Institutes: | Biochemie, Chemie und Pharmazie |
Dewey Decimal Classification: | 5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie |
Sammlungen: | Universitätspublikationen |
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität) | |
Licence (German): | ![]() |