Open Access

Lina Sagert

• Information about the health status of most nucleated cells is provided through peptides presented on major histocompatibility complex I (pMHC I) on the cell surface. T cell receptors of CD8+ T cells constantly monitor these complexes and allow the immune system to detect and eliminate infected or cancerous cells. Antigenic peptides displayed on MHC I are typically derived from the cellular proteome and are translocated into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) by the ATP-binding cassette (ABC) transporter associated with antigen processing (TAP), which is part of the peptide-loading complex (PLC). In a process called peptide editing, the MHC I-dedicated chaperone tapasin (Tsn) selects peptides for their ability to form stable complexes with MHC I. While initial peptide loading is catalyzed in the confines of the PLC, the second quality control is mediated by TAPBPR, operating in the peptide-depleted cis-Golgi network. TAPBPR was shown to have a more fine-tuning effect on the presented peptide repertoire rather than initial peptide selection. The fundamental mechanism of peptide editing was illuminated by two crystal structures of TAPBPR in complex with peptide-receptive MHC I. Notably, one of these structures reported a structural element that inserted into the peptidebinding pocket. The so-called scoop loop was assumed to be involved in mediating peptide exchange but the underlying mechanism remained undefined. Additionally, latest results suggested that TAPBPR mediates the interaction of the glucosyltransferase UGGT1 with peptide-receptive MHC. To expand the current knowledge of quality control processes in the antigen presentation pathway, the contribution of the scoop loop in peptide editing and the role of TAPBPR in UGGT1-mediated quality control needs to be elucidated. In the first part of this study, TAPBPR proteins with various loop lengths were designed to scrutinize the contribution of the scoop loop in chaperoning peptidereceptive MHC I. In a light-driven approach, the ability of TAPBPR variants to form stable complexes with peptide-free MHC I was tested. These results demonstrated that in a peptide-depleted environment, the scoop loop is of critical importance for TAPBPR to chaperone intrinsically unstable, peptidereceptive MHC I clients. Moreover, fluorescence polarization-based assays allowed the pursuit of peptide exchange in different, native-like environments. Peptide displacement activities of TAPBPR variants illustrated that catalyzed peptide editing is primarily induced by structural elements outside the scoop loop. In a peptide-depleted environment, the scoop loop occupies the position of the peptide C-terminus and acts as an internal peptide surrogate. By combining complex formation and fluorescence polarization experiments, the scoop loop of TAPBPR was shown to be critically important in stabilizing empty MHC I and functions as an internal peptide selector. In the second part of this study, a novel in-vitro glucosylation assay was established to examine the role of TAPBPR in UGGT1-catalyzed re-glucosylation of TAPBPR-bound MHC I clients. Therefore, a peptide-free MHC I-TAPBPR complex with defined glycan species was designed which served as physiological substrate for UGGT1. By subjecting the recombinantly expressed HLA-A*68:02- TAPBPR complex and UGGT1 proteins to the new in-vitro system, UGGT1 was shown to catalyze the transfer of a glucose residue to the N-linked glycan of TAPBPR-bound Man9GlcNAc2-HLA-A*68:02. Moreover, a high-affinity, photocleavable peptide was applied to dissociate the MHC I-chaperone complex. However, in the absence of TAPBPR, no glucosyltransferase activity was observed. Generation of peptide-free MHC I through UV illumination also showed no activity, and only the addition of TAPBPR could restore UGGT1-mediated reglucosylation of the empty MHC I. Independent of the peptide status of HLAA*68:02, the combination of protein glycoengineering and LC-MS analysis implicated that UGGT1 exclusively acts on TAPBPR-chaperoned HLA-A*68:02. The newly established system provided insights into the function of TAPBPR during UGGT1-catalyzed re-glucosylation activity and quality control of MHC I. Taken together, the scoop loop allows TAPBPR to function as MHC I chaperone through stabilizing peptide-receptive MHC I. In a peptide-depleted environment, the loop structure serves as an internal peptide surrogate and can only be dislodged by a high-affinity peptide. Based on these findings, TAPBPR fulfills a dual function in the second level of quality control. On the one hand, TAPBPR functions as peptide editor, shaping the repertoire of presented peptides. On the other hand, TAPBPR mediates peptide-receptive MHC I clients to the folding sensor UGGT1. Here, TAPBPR is essential to promote UGGT1-catalyzed reglucosylation of the N-linked glycan, giving MHC I a second chance to be loaded with an optimal peptide cargo in the peptide loading complex.
• Informationen über den Gesundheitszustand der meisten zellkernhaltigen Zellen werden durch Klasse I Haupthistokompatibilitatskomplexe (major histocompatibility complex class I, MHC I) bereitgestellt, welche Peptide an der Zelloberfläche präsentieren. Die T-Zell Rezeptoren von CD8+ T-Zellen überwachen diese Komplexe ständig und ermöglichen es dem Immunsystem, infizierte oder krebsartige Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Antigene Peptide, welche auf MHC I Proteinkomplexen präsentiert werden, stammen in der Regel aus dem zellulären Proteom. Diese werden durch den transporter associated with antigen processing (TAP), welcher Teil des Peptidbeladungskomplexes (peptide loading complex, PLC) ist, aus dem Zytosol in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (endoplasmic reticulum, ER) transportiert. MHC I Komplexe setzen sich aus einer polymorphen, schweren Kette (heavy chain, hc) und ß2- Microglobulin (ß2m) zusammen. Nach der Assemblierung des ß2m-MHC I-hc Heterodimers im ER wird dieses an den PLC rekrutiert, wo das intrinsisch instabile, peptidfreie MHC I Molekül durch das MHC I-spezifische Chaperon Tapasin (Tsn) stabilisiert wird18. Im PLC katalysiert Tsn das sogenannte peptide editing, indem Peptide nach ihrer Eigenschaft ausgewählt werden, stabile Komplexe mit MHC I (pMHC I) zu bilden. Während die initiale Peptidbeladung am PLC katalysiert wird, erfolgt eine zweite, TAPBPR-vermittelte Qualitätskontrolle im peptidarmen ER/cis-Golgi-Netzwerk. Bisherige Studien haben gezeigt, dass TAPBPR hierbei mehr an der Feinabstimmung des dargebotenen Peptidrepertoires als an der anfänglichen Peptidauswahl beteiligt ist. Der grundlegende Mechanismus der Peptideditierung konnte durch zwei Kristallstrukturen aufgeklärt werden, welche TAPBPR im Komplex mit peptidempfänglichem MHC I darstellten. Allerdings wies nur eine der beiden Strukturen ein Element auf, welches in die Peptidbindungstasche hineinragte. Basierend auf dieser Struktur wurde angenommen, dass der sogenannte ‘‘Scoop Loop‘‘ eine wesentliche Rolle beim Peptidaustausch und der Stabilisierung von peptidfreiem MHC I spielt, allerdings ist der zugrundeliegende Mechanismus noch nicht vollständig geklärt. Zusätzlich deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass TAPBPR die Interaktion der Glucosyltransferase UGGT1 mit MHC I vermittelt, wenn sich dieses in einem suboptimalen oder leeren Peptidbeladungsstatus befindet. Um das derzeitige Wissen über Qualitätskontrollprozesse im Antigenpräsentationsweg zu erweitern, müssen der Beitrag des Scoop Loops bei der Peptidbeladung und die Rolle von TAPBPR bei der UGGT1-vermittelten Qualitätskontrolle aufgeklärt werden. Ein charakteristisches Merkmal während des Peptidaustausches ist der peptidfreie Übergangszustand, welche MHC I Moleküle durchlaufen. Um diesen hochenergetischen Zwischenzustand zu überwinden, stabilisieren MHC Ispezifische Chaperone wie TAPBPR und Tsn das Molekül und senken dadurch die Energiebarriere vor dem Wiedereintritt eines neuen, hochaffinen Peptids. Um die Rolle des Scoop Loops bei der Stabilisierung von intrinsisch instabilen, peptidfreien MHC I-Klienten zu untersuchen, wurden im ersten Teil dieser Arbeit TAPBPR-Varianten mit unterschiedlichen Loop-Längen entworfen. Im TAPBPRTsn-SL-Konstrukt wurde der Scoop Loop durch den kürzeren Loop von Tsn ersetzt, wohingegen im TAPBPRßSL-Konstrukt der gesamte Loop durch drei Glycine ersetzt wurde. Um die Fähigkeit der TAPBPR-Varianten, stabile MHC I-TAPBPR Komplexe zu bilden zu testen, wurde das Maus-MHC I H2-Db verwendet, welches mit einem hochaffinen, fotospaltbaren Peptid zurückgefaltet wurde. In einem Licht gesteuerten Ansatz wurde das fotospaltbare Peptid durch UV-Licht in zwei niederaffine Fragmente gespalten, welche durch die Bindung von TAPBPR aus der Peptidbindungstasche verdrängt wurden. Es konnte gezeigt werden, dass alle TAPBPR-Varianten prinzipiell in der Lage waren, MHC I-TAPBPR Komplexe zu bilden, allerdings wurden unterschiedliche Lebenszeiten der Komplexe festgestellt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der physiologischen Umgebung beider Chaperone. Tsn katalysiert die initiale Peptidbeladung in der peptidreichen Umgebung des PLCs21, wo instabile MHCs zusätzlich durch weitere PLC-Komponenten stabilisiert werden. TAPBPR hingegen agiert als einzelnes MHC I-Chaperon außerhalb des PLCs, wo die Peptidkonzentrationen drastisch niedriger sind23. Physiologisch betrachtet scheint ein längeres Loop Element notwendig zu sein, um peptidempfängliche MHC I über einen längeren Zeitraum zu stabilisieren. Zusammengefasst demonstrierten die Komplexbildungs experimente, dass der Scoop Loop in einer peptidarmen Umgebung für die Stabilisierung von peptidempfänglichem MHC I essenziell ist.