Open Access

Victoria Georgi

• A necessary requirement for a pharmacological effect is that a drug molecule tightly interacts with its disease relevant target molecule in the patient. Kinases are regulatory, signal transmitting enzymes and are a large protein family that belongs to the most frequent targets of pharmaceutical industry, as deregulation of kinases has been associated with the development of a variety of diseases, including cancer. In drug discovery, equilibrium binding metrics such as the affinity (Ki, KD) or potency (IC50, EC50) are usually applied for the systematic profiling for potent and selective drug candidates. In recent years, dynamic binding parameters, the drugs association (kon) and dissociation (koff) rates for desired primary-targets and undesired off-targets, were discussed to be better predictors than steady-state affinity per se (KD = koff / kon) for the onset and duration of the drug-target complex in the open in vivo environment and thereby for the therapeutic effect and safety of the drug. It is yet unclear whether and when the binding kinetics parameters can influence drug action in the complex context of pharmacokinetics and pharmacodynamics and how the kinetic rate constants can be optimized rationally. One major obstacle for providing proof for the hypothesis that drug binding kinetics is of importance for drug action is the generation of large and comparable binding kinetic datasets. The aim of this thesis was the comprehensive analysis of the binding kinetic and affinity parameters of a diverse spectrum of 270 small-molecule kinase inhibitors against a panel of pharmacologically relevant kinases to study the role played by binding kinetics for drug discovery: The generated dataset was utilized to assess the effect of chemical properties on drug binding kinetics, and to evaluate the impact of kinetic rate constants on the success of compounds in the drug discovery pipeline. Large scale profiling was made possible by a recently developed “kinetic Probe Competition Assay” (kPCA), whose evaluation is based on Motulsky’s and Mahan’s “kinetics of competitive binding” theory. Monte Carlo analyses performed in this dissertation widened the theoretical knowledge of this theory, provided new insights into its limitations and allowed to derive recommendations about how to best design assays. It was demonstrated that kPCA is indeed high-throughput compatible and that it is comparable to other biochemical and biophysical assay formats in terms of precision and accuracy. Multivariable linear regression for the description of the determined kinase inhibitors’ target binding characteristics (kon or koff or KD) using molecular properties and/or particular kinase-inhibitor interactions as descriptors supported the assumption that molecular properties of compounds might affect binding kinetics, generated new hypothesis about molecular determinants influencing binding kinetic parameters and provided a rational basis for following structure-kinetic relationship studies. Remarkably, the binding kinetic rate constants were better described by the established models than binding affinities. Interestingly, the systematic, quantitative analysis of kinase inhibitors’ target binding kinetics indicated that a slow dissociation rate for the main target is a feature which is more frequently observed in inhibitors that reached approval or late stage clinical testing than in earlier phases of clinical development. In addition, it was demonstrated that binding kinetics of kinase inhibitors is a better predictor for the time course of target engagement in cells as compared to affinity per se. Furthermore, in some study cases simulations using a standard pharmacokinetics model and a modified model considering the inhibitors binding kinetics lead to different in vivo kinase occupancy time profiles. It was illustrated by simulations how the concept of kinetic selectivity can be applied to turn an unselective compound in equilibrium conditions into a more selective compound in the open in vivo situation, where the thermodynamic equilibrium of drug-target binding is not necessarily reached. Thus the generated data and models provide evidence for the importance of binding kinetics in drug discovery and represent a valuable resource for future studies in this field.
• Eine Grundvoraussetzung für die pharmakologische Wirkung von Arzneimitteln ist, dass der Wirkstoff an krankheitsrelevante Zielmoleküle (sogenannte Targets) des Patienten bindet. Eine der häufigsten Zielmolekülklassen der pharmazeutischen Industrie sind Kinasen, regulatorische und signalübermittelnde Enzyme, deren Fehlregulation zur Entwicklung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, führen kann. Für die systematische Suche nach potenten und selektiven Wirkstoffkandidaten, die an Zielmoleküle binden, kommen in der Arzneimittelforschung meist Gleichgewichts-basierte Bindungsmaße wie Affinität (Ki, KD) oder Potenz (IC50, EC50) zum Einsatz. In den letzten Jahren wurde diskutiert, ob dynamische Bindungsparameter, die Assoziationsrate (kon) und die Dissoziationsrate (koff) des Wirkstoffs für das gewünschte Target und für unerwünschte Antitargets, im Vergleich zur Affinität per se (KD = koff / kon) besser geeignet sind, um die Entstehung und die Verweildauer des Wirkstoff-(Anti)Target-Komplexes in vivo und damit die therapeutische Wirkung und Sicherheit des Arzneimittels vorherzusagen. Es ist noch wenig erforscht, ob und wann Bindungskinetik den pharmazeutischen Effekt im komplexen Zusammenhang mit Pharmakokinetik und Pharmakodynamik beeinflussen kann und wie diese kinetischen Geschwindigkeitskonstanten rational optimiert werden können. Der Mangel an umfangreichen, direkt vergleichbaren Bindungskinetik-Datensätzen ist ein wesentliches Hindernis für ein besseres Verständnis des Themas. Das Ziel dieser Dissertation ist eine umfassende Analyse der Bindungskinetik- und Affinitäts-parameter eines diversen Sets von 270 niedermolekularen Kinaseinhibitoren für eine Reihe pharmakologisch relevanter Kinasen, um die Wichtigkeit der Bindungskinetik für die Arzneimittelforschung einzuschätzen: Anhand der neu generierten Daten soll der Einfluss von physikochemischen Eigenschaften auf Bindungskinetik, sowie die Relevanz von kinetischen Bindungseigenschaften für den klinischen Erfolg von Compounds untersucht werden. Die umfangreiche Untersuchung wurde durch den kürzlich entwickelten „kinetic Probe Competition Assay“ (kPCA, engl. für kinetischer Sonden-Kompetitions-Test, kPCA) ermöglicht, dessen Evaluierung auf Motulskys und Mahans „Kinetik der kompetitiven Bindungstheorie“ beruht. Monte-Carlo-Analysen, die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführt wurden, konnten zu einem besseren theoretischen Verständnis dieser Methode beitragen, lieferten neue Einblicke in ihre Grenzen und erlaubten es, Empfehlungen für das Assaydesign abzuleiten. Es zeigte sich, dass kPCA in der Tat hochdurchsatzfähig und bezüglich Präzision und Genauigkeit mit anderen biochemischen und biophysikalischen Assayformaten vergleichbar ist. Multivariable lineare Regression zur Beschreibung der gemessenen Kinaseinhibitor-Target Bindungsparameter (kon, koff oder KD) unter Verwendung von molekularen Eigenschaften und/oder bestimmten Kinase-Inhibitor-Wechselwirkungen als Deskriptoren konnte die Annahme bestätigen, dass molekulare Eigenschaften von Verbindungen die Bindungskinetik beeinflussen können, und es konnten neue Hypothesen über molekulare Determinanten aufgestellt werden, die bestimmte Bindungseigenschaften hervorrufen könnten. Dies liefert eine rationale Grundlage für folgende Studien zur Untersuchung der Struktur-Bindungskinetik Beziehung. Bemerkenswerterweise konnten die bindungskinetischen Geschwindigkeitskonstanten durch die Modelle besser beschrieben werden als die Affinität. Die systematische, quantitative Analyse der Inhibitor-Kinase-Bindungskinetikdaten zeigte interessanterweise, dass eine langsame Dissoziationsrate vom Haupttarget ein Merkmal ist, das bei Inhibitoren in fortgeschrittenen klinischen Entwicklungsphasen häufiger auftritt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Bindungskinetik von Kinaseinhibitoren im Vergleich zur Affinität per se besser geeignet ist, um den zeitlichen Verlauf der Zielmolekülbelegung in Zellen zu simulieren. Darüber hinaus führt die Simulation mit einem traditionellen Pharmakokinetik-Modell und einem modifizierten Modell, das zusätzlich die Bindungskinetik der Inhibitoren berücksichtigt, in einigen Fällen zu verschiedenen in vivo Kinasebindungs-Zeitprofilen. Es wurde durch Simulationen illustriert, wie das Konzept der kinetischen Selektivität verwendet werden könnte, um dafür zu sorgen, dass ein unter Gleichgewichtbedingungen unselektiver Inhibitor im offenen in vivo System, in dem das thermodynamische Gleichgewicht der Medikament-Target-Bindung nicht immer erreicht wird, selektiver ist. Die generierten Daten und Modelle dieser Arbeit liefern Hinweise auf die Relevanz der Bindungskinetik in der Wirkstoffforschung und stellen eine wertvolle Ressource für zukünftige Studien auf diesem Gebiet dar.