Open Access

Christian Brendel

• Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung. Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge. Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren. In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird. Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen. Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert. Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
• Gene therapy is considered to be particularly useful for the treatment of monogenetic primary immune deficiencies (PIDs). About 150 different types of PIDs are currently recognized by the World Health Organization. Many affected individuals suffer from very severe symptoms which are associated with the increased risk of infections. Although most disease types can be treated with conventional medication such as antibiotics and immunoglobulin infusions, the only curative treatment available for severe forms of PIDs is hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) from a matched healthy donor. Finding a histocompatible donor remains a problem for many patients in need for HSCT, particularly for minority groups which are underrepresented in registries of volunteer donors. For these patients, gene therapy of autologous hematopoietic stem cells has proven to be an alternative. This was clearly demonstrated in clinical trials for two forms of the Severe Combined Immunodeficiency (ADA‐SCID, SCID‐X1). Another example of a successfully performed gene therapy for a very severe PID is the Frankfurt clinical trial for treatment of the X‐linked form of Chronic Granulomatous Disease (X‐CGD). XCGD is a rare inherited immunodeficiency caused by mutations in the gp91phox subunit of the phagocytic NADPH‐oxidase. Due to the lack of NAPDH‐oxidase activity, neutrophils of X‐CGD patients are unable to generate superoxide which is required for the killing of pathogens. As a consequence, CGD patients suffer from severe and recurrent life‐threatening infections. In the Frankfurt gene therapy trial for X‐CGD, patient derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells were treated with a γ‐retroviral vector encoding for the therapeutic transgene gp91phox under control of an SFFV‐LTR. A decline of transgene expression over time was detected, which was due to CpG methylation at the promoter region within the viral LTR. In addition, expansion of individual hematopoietic clones caused by the activation of growth promoting genes near the viral integration sites was observed. This ultimately led to the development of a preleukemic disease state called myelodysplastic syndrome. Despite clear benefits from gene therapy for most patients, the occurrence of clonal expansion of genemodified cells in the X‐CGD trial and severe adverse events in the X‐SCID trials clearly demonstrate the requirement for new vectors with reduced genotoxicity. In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal myeloid specific promoters were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration profile. The use of myeloid specific promoters to drive expression of the therapeutic transgene gp91phox should further improve the safety profile of these new‐generation vectors. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due to the aberrant expression of gp91phox while at the same time the full clinical benefit for the patients is maintained. In order to find a suitable candidate which fulfills the requirements, five candidate therapeutic vectors harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments. The regulatory elements used to drive expression of codon optimized gp91phox were the microRNA223 promoter (223), a chimeric promoter consisting of a fusion between the cathepsin G and c‐Fes promters (chim), the myeloid related protein 8 promoter (MRP8), and two vectors where an ubiquitous‐acting chromatin element (UCOE) was placed upstream of the MRP8‐promoter in forward (UFM) or reverse orientation (URM). The UCOE is derived from the human HNRPA2B1‐CBX3 locus and was used in order to achieve increased and sustained transgene expression and counteract silencing. This work focuses on the topics of transgene expression levels, specificity of the expression for myeloid cells and functional reconstitution of NADPH‐oxidase activity. The issues of long term expression, propensity to methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first step the performance of different vectors was evaluated in the human myelomonocytic gp91phox‐deficient cell line PLB985, were the UFM‐vector could be excluded from further experiments because of insufficient regulatory capacity. Based on promising data from ex vivo differentiated primary hematopoietic stem and progenitor cells of human and murine origin, the two vectors carrying the miR223 and the chimeric promoters were selected for in vivo transplantation experiments. In summary, both vectors mediated high and copy number dependent expression of the transgene (up to wild type levels) with high fidelity in myloid cells. Myeloid specificity was shown by the lack of transgene expression in lymphoid lineages. A strong upregulation of gp91phox expression during the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells into granulocytes could be shown in vitro and in vivo for murine and human gp91phox‐deficient cells, leading to an efficient reconstitution of NADPH‐oxidase activity. The expression was stable over an extended period of time (24 weeks) with no signs of epigenetic silencing or any signs of hematologic abnormalities. In mice treated with the 223‐promoter vector, a truly myeloid restricted expression pattern of gp91phox was observed while the expression from the chimvector was slightly less specific, but also stronger and a better functional correction of granulocytes was achieved. In conclusion, when comparing the newly generated lentiviral vectors with the γ‐retroviral constructs used in clinical trials for X‐CGD so far, major improvements in vector safety and transgene expression have been achieved. This will likely be reflected by better therapeutic results and less severe adverse events in a future gene therapy trial.