Open Access

Markus Braner

• A great challenge in life sciences remains the site-specific modification of proteins with minimal perturbation for in vitro as well as in vivo studies. Therefore, different chemoselective reactions and semi-synthetic techniques such as native chemical ligation or intein-mediated protein splicing have been established. They enable a site-specific incorporation of chemical reporters into proteins, such as organic fluorophores or unnatural amino acids. In this PhD Thesis, protein trans-splicing was guided by minimal high-affinity interaction pairs to trace proteins in mammalian cells. In addition, the temporal modulation of cellular processes by photo-cleavable viral immune evasins was achieved. Protein trans-splicing mediated by split inteins is a powerful technique for site-specific and 'traceless' protein modifications. Despite recent developments there is still an urgent need for ultra-small high-affinity intein tags for in vitro and in vivo approaches. So far, only a very few in-cell applications of protein trans-splicing are reported, all limited to C-terminal protein modifications. Here, a strategy for covalent N-terminal intein-mediated protein labeling at sub-nanomolar probe concentrations was developed. Combined with the minimalistic Ni-trisNTA/His-tag interaction pair, the affinity between the intein fragments was increased 50-fold (KD ~ 10 nM). Site-specific and efficient 'traceless' protein modification by high-affinity trans-splicing is demonstrated at nanomolar concentrations in mammalian cells. High background originating from non-reacted, 'always-on' fluorescent probes still is a crucial issue in life sciences. Covalent labeling approaches with simultaneous activation of fluorescence are advantageous to increase sensitivity and to reduce background signal. Therefore, high-affinity protein trans-splicing was combined with fluorophore/quencher pairs for online detection of covalent N-terminal protein labeling in cellular environments. Substantial fluorescence enhancement at nanomolar probe concentrations was achieved. This ultra-small fluorogenic high-affinity split intein system is an unprecedented example for real-time monitoring of the trans-splicing reaction in cell-like environments as well as for protein labeling with fluorogenic probes at nanomolar concentrations. To extend the field of chemical immunology and to address spatiotemporal aspects in adaptive immune response, new tools to control antigen processing are required. Therefore, synthetic photo-conditional viral immune evasins were designed to modulate antigen processing on demand. By using light, the time and dose controlled antigen translocation by the transporter associated with antigen processing (TAP) was triggered with response in the second regime. Peptide delivery and loading by the peptide-loading complex (PLC) was rendered inactive, whereas blocking was abolished in a light-controlled fashion to inactivate the synthetic viral immune evasin ICP47 along with simultaneous activation of the antigen presentation pathway. Lightresponsive peptide translocation by the TAP complex was assayed in vitro by utilizing microsomes isolated from professional antigen presenting B-cell lymphomas (Raji). To extend these studies, suppression and photo-controlled rescue of antigen presentation was examined at single-cell resolution in human primary immune cells. Native chemical ligation interconnects peptide chemistry with recombinantly expressed proteins. This technique was applied to generate the semi-synthetic full-length ICP47. Although this approach was realized, the low product yield was not sufficient for further functional studies. Therefore, full-length ICP47 was consecutively generated by utilizing a full synthetic four-fragment ligation approach. However, this synthetic viral immune evasin was not able to block peptide translocation in a robust way.
• Die selektive Markierung und Modifikation von Proteinen in zellulären Systemen stellt eine besondere Herausforderung in den Lebenswissenschaften dar. Durch Protein-Semisynthese können unterschiedliche Reportergruppen und Modifikationen, beispielsweise Fluorophore oder unnatürliche Aminosäuren, mit dem Zielprotein verknüpft werden. Somit könnten wichtige Einblicke in die Funktion, Interaktion und Dynamik von Proteinen und Proteinkomplexen gewonnen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Methoden zur effizienten "spurlosen" Proteinmodifikation sowie zur Synthese und Applikation von lichtgesteuerten Proteinen entwickelt. Die ortsspezifische und minimal störende Modifizierung von Proteinen für in vitro und in vivo Studien bleibt eine zentrale Herausforderung in den Lebenswissenschaften. Hierfür wurden verschiedene Techniken wie beispielsweise die native chemische Ligation (NCL) oder Intein-vermitteltes Protein Trans-Spleißen (PTS) etabliert. Beide Methoden basieren auf einer chemoselektiven Fusion eines synthetischen Peptids mit einem rekombinant exprimierten Protein. Im Fall der Inteine wird eine autokatalytische Domäne in zwei Fragmente gespalten, um PTS zu vermitteln. Beide Fragmente assoziieren zunächst und rekonstruieren das katalytisch aktive Intein. Im darauffolgenden Spleißprozess schneidet sich das Intein selbstständig heraus, wobei die flankierenden Exteine über eine native Peptidbindung miteinander verknüpft werden. Diese Verknüpfung beider Exteine erfolgt nahezu spurlos, da nur einige für die Spleißaktivität essentielle Exteinreste am modifizierten Protein verbleiben. Allerdings wird die synthetische Zugänglichkeit maßgeblich durch die typische Fragmentgröße (100-130 Aminosäuren für das C-terminale Inteinfragment IntC, 35-50 Aminosäuren für das N-terminale Inteinfragment IntN) beeinträchtigt. Die in vivo Anwendbarkeit kleinerer komplementärer Inteinfragmente wird aufgrund ihrer mikromolaren Affinitäten allerdings vermindert. Daher sind sehr kleine und hoch-affine Inteine für intrazelluläre Anwendungen von besonderem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein hoch-affines Inteinsystem für die kovalente N-terminale Proteinmarkierung in vivo entwickelt werden, das von einem sehr kleinen Interaktionspaar geleitet wird. Hierfür wurde das künstlich gespaltene Ssp DnaB Miniintein von Synechocystis sp. PCC6803 mit dem minimalistischen hoch-affinen Ni-trisNTA/His-tag Element (< 2 kDa) kombiniert. Dieses Inteinsystem besteht aus einem synthetischen IntN und Ni-trisNTA (11 Aminosäuren) sowie aus einem rekombinanten His-getaggten IntC Fragment (143 Aminosäuren), welches mit dem entsprechenden Zielprotein genetisch fusioniert wurde. Aufgrund des Ni-trisNTA/His-tag Interaktionspaares konnte eine mehr als 50-fache Erhöhung der Affinität (KD ~ 10 nM) für die Inteinfragmente bestimmt werden. Die Affinität von nichtmodifiziertem IntC-Trx-H6 (ICTH) und IN (IntN-ExtN) wurde mit einem KD = 350 ± 60 nM bestimmt. Eine ähnliche Affinität wurde für HICT beobachtet. Eine zweifach schwächere Affinität wurde für HICT und IN-trisNTA erhalten, was darauf hinweist, dass die Inteinkomplexbildung möglicherweise sterisch durch trisNTA behindert wird. Entscheidend ist jedoch, dass die intrinsischen Eigenschaften des Inteins (hinsichtlich Ausbeuten und Kinetik der Spleißproduktbildung) nicht beeinträchtigt wurden. Während eine spezifische und kovalente Proteinmarkierung bei mikromolaren Konzentrationen erzielt wurde, konnte das Trans-Spleißen bei pikomolaren Konzentrationen nur in Gegenwart des Ni-trisNTA/His-tag Interaktionspaares realisiert werden. Identische Resultate für das Trans-Spleißen konnten in der komplexen Umgebung von Säugetierzelllysat erzielt werden. Um PTS in vivo durchzuführen, wurden die synthetischen IN Fragmente mittels Zell-Squeezing sowie durch Semipermeabilisierung mit Streptolysin O in lebende Säugertierzellen eingeschleust. Für gesqueezte Zellen konnte so eine Hochdurchsatzanalyse (~ eine Million Zellen pro Sekunde) von intrazellulärem Trans-Spleißen ermöglicht werden. Die entsprechenden Cargo-Moleküle (Cy5-markiertes IN, I N-trisNTA und IN-Ni-trisNTA) wurden effektiv in HeLa-Zellen, welche mit einem für HIC-mEGFPNLS kodierenden Plasmid transfiziert wurden, eingebracht. Im nanomolaren Bereich konnte die Spleißproduktbildung ausschließlich mit IN-Ni-trisNTA beobachtet werden, während mikromolare Konzentrationen von nicht-modifiziertem IN für eine vergleichbare Markierungseffizienz erforderlich waren. Es ist zu betonen, dass das Trans-Spleißen bei sehr niedrigen Konzentrationen von IN-Ni-trisNTA (100 nM) ausschließlich in Zellen detektiert wurde. Obwohl die Effizienz der Spleißreaktion in vivo deutlich geringer war als in vitro, wurde das Trans-Spleißen im zellulären Umfeld durch das sehr kleine Interaktionspaar geleitet und gefördert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Trans-Spleißen in Kombination mit einem hoch-affinen Interaktionspaar zu kovalenten Proteinmodifikationen in humanen Zellen im nanomolaren Konzentrationsbereich führt. Somit konnte die erste intrazelluläre Applikation von semisynthetischem N-terminalem PTS entwickelt werden. Eine Herausforderung in zellulären Systemen ist der hohe Hintergrund an nicht reagierten fluoreszierenden Sonden, da Waschschritte nicht immer anwendbar sind. Daher sind kovalente Markierungsmethoden einhergehend mit einer Aktivierung der Fluoreszenz von Vorteil. So kann die Empfindlichkeit erhöht und das Hintergrundsignal reduziert werden. Aus diesem Grund wurde das entwickelte hoch-affine Inteinsystem mit blau-absorbierenden (Carboxyfluorescein/Dabcyl) sowie rot-absorbierenden (sCy5/BHQ-3) Fluorophor/Quencher (F/Q)-Paaren kombiniert. Dies ermöglicht eine Echtzeitverfolgung der Spleißreaktion und somit von kovalenter N-terminaler Proteinmarkierung. Der gleichzeitige Einbau eines Fluorophors und des jeweiligen Quenchers in IN führte zu einer Fluoreszenzlöschung, wohingegen eine starke Fluoreszenzzunahme während der Spleißreaktion beobachtet wurde. Die Affinitäten zwischen IN und IC wurden durch den F/Q-Einbau nicht beeinflusst. Mittels dieses Inteinsystems konnten detaillierte kinetische Analysen (kon, kPTS) durchgeführt werden. Diese ergaben, dass die Assoziation der Inteinfragmente durch das sehr kleine, hoch-affine Interaktionspaar geleitet wird. Aufgrund dieser Resultate wurde das Trans-Spleißen in Echtzeit im Säugetierzelllysat verfolgt. Dabei konnte die Spleißreaktion in Echtzeit im nanomolaren Bereich nur beobachtet werden, wenn das Trans-Spleißen durch das Ni-trisNTA/His-tag Element unterstützt wurde. Es ist hervorzuheben, dass die Reaktionskinetik der Spleißreaktion weder durch den Einbau von Fluorophor und Quencher, noch durch die zellähnliche Umgebung beeinflusst wurde. Das hier entwickelte fluorogene hoch-affine Inteinsystem ist ein herausragendes Beispiel für die Echtzeitüberwachung der Spleißreaktion im Zelllysat sowie für die Proteinmodifikation mit fluorogenen Sonden bei nanomolaren Konzentrationen. Bisher wurde keine genetisch oder enzymatisch basierende Technologie entwickelt, um photospaltbare β-Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubauen. Deshalb wurde eine synthetische sowie semisynthetische Methode zur Herstellung von lichtgesteuerten viralen Proteine entwickelt. Die Antigenpräsentation über Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse I (MHC I) spielt eine wichtige Rolle in der adaptiven Immunität. Professionelle Antigenpräsentierende Zellen, beispielsweise dendritische Zellen oder B-Zellen, sind die Hauptakteure, um antigene Peptide mit Hilfe von MHC I-Molekülen auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Die Peptid-MHC I-Komplexe werden daraufhin von Antigen-spezifischen CD8+ T-Lymphozyten (CTLs) erkannt und virusinfizierte oder maligne transformierte Zellen werden nach einer spezifischen Erkennung durch CTLs eliminiert. Der Transporter assoziiert mit der Antigenprozessierung (TAP), als zentraler Bestandteil der makromolekularen Peptidbeladungsmaschinerie (PLC), ist dabei von entscheidender Bedeutung in der Antigenverarbeitung. TAP transportiert proteasomale Abbauprodukte in das endoplasmatische Retikulum (ER), wo diese anschließend auf MHC I-Moleküle geladen werden. Bei der Manipulation des Immunsystems durch Viren ist der PLC mit TAP ein naheliegendes Ziel. Daher haben beispielsweise Herpes-simplex-Viren (HSV) virale Faktoren wie das intrazelluläre Protein ICP47 (~ 88 Aminosäuren) entwickelt, um die Peptidbindung an TAP zu inhibieren. Die aktive Domäne des viralen Faktors umfasst die N-terminalen Reste 2-34. Diese Region ist ausreichend, um die Peptidtranslokation mit hoher Affinität zu inhibieren, wodurch die Antigenzufuhr von MHC I-Molekülen blockiert wird. Während diese Domäne im Zytosol unstrukturiert vorliegt, bildet sie bei einer Assoziation an Lipidmembranen und TAP eine Helix-Loop-Helix-Sekundärstruktur aus. Die Region neben der aktiven Domäne (Aminosäurereste 35-55) unterstützt die konformationelle Arretierung von TAP. Obwohl viele Schritte in der Antigenprozessierung bekannt sind, ist unklar, wie die entsprechenden Schritte und der Fluss von Antigenen in Raum und Zeit moduliert werden. Um diese räumlichen und zeitlichen Aspekte in der adaptiven Immunantwort zu adressieren, sind neue Werkzeuge zur Kontrolle der Antigenprozessierung erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde TAP als Bestandteil des PLC selektiv und effizient durch photokonditioniertes (pc) ICP47 inaktiviert. Diese Blockade konnte mittels Licht aufgehoben werden, wobei pc-ICP47 inaktiviert und gleichzeitig die Antigenpräsentation aktiviert wurde. Natives sowie photokonditioniertes ICP47 wurde per Fmoc Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Die photospaltbare β-Aminosäure Amino-3(2-nitrophenyl)propionsäure (Anp) wurde in der R- und S-Stereokonfiguration innerhalb des flexiblen Loop-Bereichs (Asn14 oder Met15) eingebaut. Dies ermöglicht eine Photospaltung von pc-ICP47 in zwei Fragmente. Insgesamt konnten sieben ICP47 Varianten (ICP472-34, pc-ICP472-3414R-Anp, pc-ICP472-3414S-Anp, pc-ICP472-3415R-Anp, pc-ICP472-3415S-Anp, sowie ICP472-55 und pc-ICP472-5515R-Anp) hergestellt werden. Alle synthetisierten viralen Faktoren zeigten eine typische α-helikale Struktur, was bedeutet, dass die photospaltbare Aminosäure Anp die Sekundärstruktur nicht beeinflusst. Die Photospaltung bei 365 nm war für alle viralen Faktoren in 60 s nahezu abgeschlossen (> 90% Spaltungseffizient). Im Anschluss an die kinetischen Studien wurde das inhibitorische Potential der ICP47 Varianten anhand eines Peptid-Kompetitionsassay untersucht. Für pc-ICP47 mit Anp an Position 15 in R- oder S-Konfiguration (pc-ICP472-3415Anp) konnte eine Inhibitionskonstante Ki ~ 125 nM ermittelt werden, während die Substitution an Position 14 (pc-ICP472-3414Anp) zu einer 4-fach schwächeren Inhibierung (Ki ~ 500 nM) führte. Im Gegensatz zu pc-ICP472-3414Anp konnte die Peptidbindung durch pc-ICP472-3415Anp nahezu komplett inhibiert werden. Mittels Photostimulation konnte für alle pc-ICP47 Varianten eine Wiederherstellung der Peptidbindungskapazität auf ~ 80% erzielt werden. Die lichtkontrollierte Peptidtranslokation des TAP-Komplexes wurde mit einem etablierten in vitro-Assay mit Mikrosomen aus Raji-Zellen untersucht. Dabei konnte die TAP-abhängige Peptidtranslokation durch pc-ICP47 auf ein ähnliches Niveau wie durch ICP47 blockiert werden. Die Inhibierung des Peptidtransports war mit pc-ICP472-3415Anp potenter als mit pc-ICP472-3414Anp, wobei die Stereochemie von Anp keinen Einfluss hatte. Nach der Photospaltung konnte für alle pc-ICP47 Varianten eine > 90% Wiederherstellung der Peptidtranslokation beobachtet werden. Auf der Basis der bisherigen Ergebnisse wurde pc-ICP472-3415R-Anp als optimaler Kandidat für weitere Studien ausgewählt. Die Position und Stereochemie (15R-Anp) wurde auf pc-ICP472-55 übertragen. Ähnliche Inhibierungskonstanten und Photokinetik sowie die Inhibierung der Peptidtranslokation konnten für ICP472-55 und pc-ICP472-55 im Vergleich zu ICP472-34 und pc-ICP472-3415R-Anp bestimmt werden. Darüber hinaus wurde die Thermostabilität von ICP47-TAP-Komplexen vor und nach der Photospaltung untersucht. Nach einer Arretierung durch ICP472-55 oder pc-ICP472-55 konnte der TAP-Komplex bei 40 °C in monodisperser Form stabilisiert werden. Nach der Photospaltung dissoziierte der pc-ICP472-55-TAP-Komplex, während der Komplex aus ICP472-55 und TAP durch die Photospaltung nicht beeinflusst wurde. Final wurden die entwickelten viralen Faktoren in professionellen Antigenpräsentierenden B-Lymphozyten sowie in humanen primären Immunzellen mittels eines etablierten einzelzellbasierenden Antigen-Translokationsassay getestet. Die Peptidtranslokation in das ER wurde in Gegenwart von ICP472-34 sowie pc-ICP472-34 auf Hintergrundniveau reduziert. Dies bestätigt, dass beide synthetischen viralen Inhibitoren TAP effizient blockieren. Die Wiederherstellung des Peptidtransports nach einer Photostimulation konnte nur im Falle von pc-ICP472-34 erreicht werden. Eine leistungsstarke Methode zur Semisynthese von Proteinen ist die native chemische Ligation (NCL), welche Peptidchemie mit rekombinanten Proteinen verbindet. Mittels dieser Methodik wurde das Volllängeprotein ICP472-88 hergestellt. Obwohl der semisynthetische Ansatz realisiert wurde, konnten aufgrund der geringen Produktausbeute keine weiteren funktionellen Studien durchgeführt werden. Bedingt durch eine ineffiziente semisynthetische NCL zur Herstellung von ICP472-88 wurde eine vollsynthetische Vierfragmentligation auf NCL-Basis in Kombination mit einer Thiazolidin-Schutzgruppenstrategie entwickelt. Allerdings war das vollsynthetische ICP472-88 trotz identischer Masse nicht in der Lage die Peptidtranslokation effizient zu blockieren. Um die für den Verlust der Inhibition verantwortliche Region zu identifizieren, wurden systematische Verkürzungen mit ICP472-42 (Fragment 1 + 2) und ICP472-61 (Fragment 1-3) durchgeführt. Überraschenderweise zeigte ICP472-61 im Vergleich zu ICP472-42 sowie ICP472-34 ein deutlich vermindertes Inhibitionspotential. Fragment 3 enthält eine konservierte Region mit einem prolinreichen PXXPLLXPP-Motiv, die für die Thermostabilisierung des TAP-Komplexes mitverantwortlich ist. Da Prolin hinsichtlich seiner cis/trans-Isomerie einzigartig ist, wurde der Einfluss der Isomerisierung auf ICP472-88 durch Inkubation mit Cyclophilin A getestet. Um diese Studien zu erweitern, wurde ICP472-88 sowohl in frisch hergestellten Zelllysaten und in einem zellfreien Expressionsystem inkubiert, sowie auf 60 °C erhitzt. Danach wurde der virale Faktor hinsichtlich seiner Inhibierung der Peptidtranslokation untersucht. Weder die Inkubation mit Cyclophilin A noch mit Zelllysaten oder Hitze bewirkte eine Erhöhung des Inhibitorpotentials. Obwohl die Vierfragmentligation erfolgreich für ICP472-88 etabliert wurde, bleibt unklar, warum die Funktion des viralen Faktors beeinträchtigt ist.