Open Access

Thilo Henß

• In the past decade, the optogenetic toolbox for the manipulation of ion currents and cNMP levels in Caenorhabditis elegans (C. elegans) expanded. However, the implemented tools for cAMP generation were soluble enzymes (euPAC, bPAC, IlaC22 k27 and PaaC) and thus they do not precisely mimic physiological cAMP signalling occurring in microdomains in close proximity to the plasma membrane. Here, cAMP is predominantly generated by membrane-bound adenylyl cyclases, that are located in microdomains together with G protein-coupled receptors (GPCRs), protein kinase A (PKA) and their targets, enabling spatially and temporal regulation of cAMP signalling. For this reason, one aim of this study was to develop and implement membrane bound photoactivatable adenylyl cyclases for the manipulation of cAMP mediated signalling in close proximity to the plasma membrane. For this purpose, the guanylyl cyclase domains of the Blastocladiella and Catenaria Cyclase Opsins (CyclOps) were mutated to adenylyl cyclases either by introducing the mutations E497K and C566D (abbreviated as (A-2x)) or by the mutations E497K, H564D, and C566T (abbreviated as (A-3x)). To determine the nucleotide specificity switch from GTP to ATP and the extent of light-dependent cAMP generation, the engineered enzymes were expressed in body wall muscle cells of C. elegans and in vitro cNMP measurements using C. elegans extracts were performed. Here, the highest levels of light induced cAMP generation during sustained stimulation (0.5 mW/mm2; 470 nm, 15 min) were detected for the variants BeCyclOp(A-2x), YFP-BeCyclOp(A-2x), and YFP-CaCyclOp(A-2x) (39, 57, 40 nM, respectively), though they did not reach the extent produced by the soluble bPAC (142 nM). In contrast, low magnitudes of generated cAMP were measured for the versions BeCyclOp(A-3x) and CaCyclOp(A-2x) (8 and 7 nM, respectively). Importantly, no obvious residual cGMP and basal activity was ascertained for any of the engineered enzymes. To assess their potential to trigger and modulate cAMP mediated cholinergic neurotransmission, and to evaluate the influence of cytosolic and membrane proximal optogenetic cAMP generation, the enzymes were expressed in cholinergic motor neurons and compared to the implemented soluble bPAC via locomotion behaviour analysis on solid and in liquid media. Photoactivation of BeCyclOp(A-2x), YFP-BeCyclOp(A-2x), and YFP-CaCyclOp(A-2x) caused similarly enhanced or even more potent behavioural changes (swimming and crawling) as bPAC, whereas a more rapidly decaying response was observed for the bPAC evoked effects. Moreover, an increased diversity of the behavioural output was detected for cytosolic cAMP production by bPAC, i.e. increased bending angles and a decreased body length. Confocal fluorescence microscopy was performed to examine the expression levels of YFP-tagged enzymes in cholinergic neurons, whereas both YFP-CyclOp(A-2x)s were expressed at similar levels, but 1.4-fold lower relative to the soluble bPAC-YFP. To compare the amount of light-dependent cAMP generation bPAC and BeCyclOp(A-2x) at light conditions that match the conditions of the behavioural experiments (30 s), cAMP measurements using C. elegans extracts were performed, whereas BeCyclOp(A-2x) depicted a 4-fold lower amount of optogenetic cAMP production than the soluble bPAC. In sum, local (membrane proximal) cAMP generation by the membrane-bound photoactivatable adenylyl cyclases may more specifically activate cAMP dependent neurotransmission of cholinergic motor neurons than cytosolic cAMP generation, i.e. an increased mobilization and priming/docking of synaptic vesicles and an increased filling of the synaptic vesicles with the neurotransmitter acetylcholine and thus an increase in locomotion behaviour. The optogenetic toolbox for the manipulation of cGMP mediated signalling in C. elegans consisted of the natural membrane-bound BeCyclOp and the artificial soluble bPGC. The latter generates cGMP with low efficiency and slow kinetics (~0.2 cGMP s-1), whereas BeCyclOp enables the production of much larger amounts of cGMP (L/D = 5000) at a high turnover rate (~17 cGMP s-1). Thus, one aim of this thesis was to implement a tool with features in between those of BeCyclOp and bPGC. Several orthologous CyclOps were assessed by Gao et al., 2015 for light-regulated cGMP production by in vitro assays based on the measurement of the cNMP content from CyclOp containing oocyte membranes. Here, CaCyclOp showed the highest ratio of light versus dark activity (L/D = 230) after BeCyclOp, and thus was selected for characterization in C. elegans...
• In den letzten zehn Jahren wurde der optogenetische Werkzeugkasten für die Manipulation von Ionenströmen und cNMP-Spiegeln in Caenorhabditis elegans (C. elegans) erweitert. Bei den eingesetzten Werkzeugen für die cAMP-Erzeugung handelte es sich jedoch um lösliche Enzyme (euPAC, bPAC, IlaC22 k27 und PaaC), so dass sie die physiologische cAMP-Signalgebung, die in Mikrodomänen in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran stattfindet, nicht genau nachahmen. Hier wird cAMP vorwiegend von membrangebundenen Adenylylzyklasen erzeugt, die sich in Mikrodomänen zusammen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), Proteinkinase A (PKA) und ihren Substraten befinden, was eine räumliche und zeitliche Regulierung der cAMP-Signalgebung ermöglicht. Ein Ziel dieser Studie war es daher, membrangebundene photoaktivierbare Adenylylzyklasen für die Manipulation der cAMP-vermittelten Signalübertragung in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran zu entwickeln und zu implementieren. Zu diesem Zweck wurden die Guanylylzyklase Domänen der Blastocladiella- und Catenaria- Cyclase Opsine (CyclOps) entweder durch die Einführung der Mutationen E497K und C566D (abgekürzt als (A-2x)) oder durch die Mutationen E497K, H564D und C566T (abgekürzt als (A-3x)) zu Adenylylzyklasen mutiert. Um den Nukleotid-Spezifitätswechsel von GTP zu ATP und das Ausmaß der lichtabhängigen cAMP-Erzeugung zu bestimmen, wurden die generierten Enzyme in Körperwandmuskelzellen von C. elegans exprimiert und in vitro cNMP-Messungen mit C. elegans Extrakten durchgeführt. Dabei wurden die höchsten Werte der lichtinduzierten cAMP-Erzeugung während konstanter Stimulation (0,5 mW/mm2; 470 nm, 15 min) für die Varianten BeCyclOp(A-2x), YFP-BeCyclOp(A-2x) und YFP-CaCyclOp(A-2x) festgestellt (39, 57 bzw. 40 nM), obwohl sie nicht das Ausmaß erreichten, welche durch das lösliche bPAC (142 nM) erzeugt wurde. Im Gegensatz dazu wurden für die Versionen BeCyclOp(A-3x) und CaCyclOp(A-2x) geringe Mengen an erzeugtem cAMP gemessen (8 bzw. 7 nM). Darüber hinaus wurde für keines der generierten Enzyme eine übriggebliebene cGMP-Erzeugung und keine basale cAMP-Erzeugung festgestellt. Um ihr Potenzial zur Auslösung und Modulation von cAMP-vermittelter cholinerger Neurotransmission zu beurteilen und den Einfluss der zytosolischen und membrannahen optogenetischen cAMP-Erzeugung zu bewerten, wurden die Enzyme in cholinergen Motoneuronen exprimiert und mit dem implementierten löslichen bPAC durch Analyse des Fortbewegungsverhaltens in festen und flüssigen Medien verglichen. Die Photoaktivierung von BeCyclOp(A-2x), YFP-BeCyclOp(A-2x) und YFP-CaCyclOp(A-2x) führte zu ähnlich verstärkten oder sogar stärkeren Verhaltensänderungen (Schwimmen und Kriechen) wie bPAC, während bei den durch bPAC hervorgerufenen Effekten eine schnellere abklingende Reaktion beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde bei der zytosolischen cAMP-Produktion durch bPAC eine größere Vielfalt der Verhaltensänderungen festgestellt, d. h. erhöhte Biegewinkel und eine verringerte Körperlänge. Mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie wurde das Expressionsniveau der YFP-markierten Enzyme in cholinergen Neuronen untersucht, wobei beide YFP-CyclOp(A-2x)s in ähnlichem Ausmaß exprimiert wurden, jedoch 1,4-fach geringer als das lösliche bPAC-YFP. Um die Menge der lichtabhängigen cAMP-Produktion von bPAC und BeCyclOp(A-2x) unter Lichtbedingungen zu vergleichen, die den Bedingungen der Verhaltensexperimente (30 s) entsprechen, wurden cAMP-Messungen mit C. elegans Extrakten durchgeführt, wobei BeCyclOp(A-2x) eine viermal geringere Menge an optogenetischer cAMP-Produktion zeigte als das lösliche bPAC. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die lokale (membranproximale) cAMP-Erzeugung durch die membrangebundenen photoaktivierbaren Adenylylzyklasen die cAMP-abhängige Neurotransmission cholinerger Motoneuronen möglicherweise spezifischer aktiviert als die zytosolische cAMP-Erzeugung, d.h. eine verstärkte Mobilisierung und Priming/Docking von synaptischen Vesikeln und eine verstärkte Füllung der synaptischen Vesikel mit dem Neurotransmitter Acetylcholin und damit eine Steigerung des Fortbewegungsverhaltens. Der optogenetische Werkzeugkasten für die Manipulation der cGMP-vermittelten Signalübertragung in C. elegans bestand aus dem natürlichen membrangebundenen BeCyclOp und dem synthetischen löslichen bPGC. Letzterer erzeugt cGMP mit geringer Effizienz und langsamer Kinetik (~0,2 cGMP s-1), während BeCyclOp die Produktion viel größerer Mengen von cGMP (L/D = 5000) bei hoher Umsatzrate (~17 cGMP s-1) ermöglicht. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, ein Werkzeug zu entwickeln, dessen Eigenschaften zwischen denen von BeCyclOp und bPGC liegen. Mehrere orthologe CyclOps wurden von Gao et al. (2015) im Hinblick auf die lichtregulierte cGMP-Produktion durch in vitro Assays bewertet, die auf der Messung des cNMP-Gehalts von CyclOp-haltigen Oozyten Membranen basieren..